细胞内线粒体的极化监控制造技术

以检测活细胞内的线粒体的极化状态的变化作为课题。使用表面等离子共振装置，检测由活细胞内的线粒体的极化状态的变化引起的表面的表面等离子共振角的变化。而且，向活细胞提供一种或多种物质，检测由于线粒体的极化状态的变化引起的表面等离子共振角的变化的步骤可以是在表面等离子共振角的变化只是由于线粒体的极化状态引起的时间段检测其变化的步骤，优选，检测从提供物质时开始２０分钟后，更优选３０分钟过后，更为优选３５分钟过后的时间段的其变化的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞内线粒体的极化监控
通过各种方法可以确认，用本专利技术的方法，可以检测线粒体 的极化状态的变化。例如，通过研究由本专利技术获得的变化率和与通过 现有技术的荧光法(在细胞内导入应答于电位的荧光色素，例如阳离子 性壹啉蓝色素，电位高的线粒体中凝集，荧光波长变化，并且通过荧 光显微镜，流式细胞仪或分光光度计等检测荧光强度根据电位变化而 变化的样子的方法)获得的线粒体的极化相关的值之间的相关性，可以 进行确认。更具体的方法，可以参照本专利技术的实施例。—般测定线粒体的极化状态变化的实验系统，C02浓度为5% 的状态的pH变化速度(本实施例5中为pHO. 004/min)，利用不受周围 空气中的C02浓度影响的组成的细胞外溶液时的pH变化速度等pH基 本保持一定的条件，如果形成线粒体的极化状态的变化不加速的状态， 在其之上的pH变化速度的条件下线粒体的极化状态的变化加速。pH 变化速度和线粒体膜电位的变化速度之间的关系根据细胞的种类和刺 激的种类而多少有些差异，pH变化速度越快，线粒体膜电位的变化速 度则越快，因此可认为其在线粒体的极化状态的变化的检测中是优选 的。可以认为优选的pH的范围根据细胞等多少有所不同。-2-甲基丙酸异丙醇 酯)，对25和50jjM添加时的脂质代谢活性进行评价。使用固so(二 甲基亚砜)作为溶剂(向培养基中添加后的最终浓度为含有 0. r/。(v/v)DMSO)。并且，作为对照，只添加DMSO使终浓度为0. 1% (v/v)。451.通过SPR进行的脂质代谢活性评价供试细胞在前培养后，从培养皿上剥离，将细胞浓度调整成在完 全培养基中2xl()e细胞/mL，将lOOinL该细胞悬浮液滴落于基板上，5。/。C02浓度下培养18小时。18小时后，将基板置于SPR传感器 上的棱镜上，用5mL的EMEM填满于基板上，开始测定。测度开始10 分钟后，更换为含有非诺贝特的培养基，再继续进行50分钟测定。其 结果是，如图2所示，尤其是添加试剂后约20分钟左右，发现了脂质 代谢的活性化所引起的线粒体的极化所导致的SPR信号的变化(-)。 48使用人胰腺癌细胞MIA PaCa-2作为供试细胞。37'C， 5%C02 浓度下，用含有100jLiM非必需氨基酸，50单位/mL青霉素，50ng/mL 链霉素，10。/。FBS(v/v)的的液体培养基EMEM培养。49而且，作为细胞凋亡诱导物质，使用槲皮素和反式-白藜,醇， 使用非细胞凋亡诱导物质声丁 (Rutin)作为阴性对照。对于使用时的最 终浓度IO, 25， 50, 100 pM，分别制备IOOO倍浓度溶液(IO， 25， 50， lOOmM)的二曱基亚砜(DMSO)作为溶剂，制成原料。501.SPR信号测定将粘附了细胞的基板置于由匹配液(matching fluid)(折射率 1. 51)介导的SPR传感器的棱镜上，用5mL的EMEM填满基板，开始SPR 信号测定。测定开始IO分钟后， 一旦除去EMEM，立即更换为含有100 MM的槲皮素，反式-白藜,醇，芦丁或曲妥单抗(Herceptin)中任一 种的新的5mL EMEM(含有终浓度为0. 1% (v/v)的作为苯酚成分的溶剂使 用的DMSO)，或者更换为只含有0, 1%的DMSO的5mLEMEM作为对照后， 继续测定50分钟。其结果是，如图5所示，尤其是给药后35分钟以 后，发现了由细胞凋亡诱导物质导致的线粒体的脱极化所引起的SPR 信号的变化(+)。评价细胞凋亡诱导物质(抗癌作用物质)的多剂联用所产生的协 同效果。作为抑制具有该协同效果的物质，采用了槲皮素和反式-白藜 ,醇。对于二者的多剂联用所产生的在细胞凋亡中的协同效果，已在 Mouria，M等人的 Food-derived polyphenols inhibit pancreatic cancer growth through mitochondrial cytochrome c release and apoptosis. Int. J. Cancer. 98， 761-769 (2002)中公开。[561.通过根据细胞数测定计算出的存活率进行多剂联用的评价 (标准法)多剂联用所产生的效果的评价，通过以下方法进行，即共同培养 供试剂和细胞，计算由于细胞凋亡而减少的细胞数。使用人胰腺癌细 胞MIAPaCa-2作为供试细胞。使用含有10%FBS (v/v) 、 50单位/ml青 霉素，50 m g/mL链霉素，100|iM非必需氨基酸EMEM (Eagles' minimum essential medium, Eagle， s最小限度基本培养基)，制成5xl0"细 胞/mL的细胞悬浮液，以每5mL—个平均分注于6cm培养皿中，于37'C, 5°化02浓度下前培养。24小时后，更换为除了上述培养基还含有 25pM槲皮素、25pM反式-白藜声醇或者25niM槲皮素和25yM反 式-白藜,醇中任一种的新的5mLEMEM(含有终浓度为0. P/。(v/v)的作 为苯酚成分的溶剂使用的DMS0)，或者更换为作为对照的只含有 0. 1。/。(v/v)的DMS0的5mL EMEM，进行培养。更换培养基48小时后， 台盼蓝染色后，用血细胞计数器计算细胞数，对于各条件以对照的细 胞数为IOO进行比较。[572.SPR信号测定装置采用上述spr传感器(角度调节型)，于37. ox:温调下进行SPR共振角测定。与存活率测定相同，调制2x 1(T细胞/mL的细胞悬 浮液，将100 iu L该细胞悬浮液滴落于SPR测度用金基板上，37 X: ， 5%C02 浓度下培养20小时。20小时后，将基板置于SPR传感器上的棱镜上， 用5mL的EMEM填满于基板上，开始测定。测度开始10分钟后，更换 为含有25jaM槲皮素、25 uM反式-白藜芦醇或者25jiM槲皮素和25 liM反式-白藜芦醇中任一种的新的5mLEMEM(含有终浓度为0. l°/。(v/v) 的作为苯酚成分的溶剂使用的DMSO)，或者更换为作为对照的只含有 0. 1%的DMSO的5mL EMEM，再继续进行50分钟SPR共振角变化的测定。58结果根据细胞数计数计算出的对照为100时的存活率示于附图说明图12。在 只给药槲皮素或反式-白藜,醇的条件下，存活率分别为76.1°/。， 56.2%，而在二者联合给药的条件下，细胞存活率为17.8°/。，获得了二 者的抗癌作用效果之和(相当于32. 3°/。的存活率)以上的抗癌作用效 果。由此，确认了槲皮素和反式-白藜声醇联用产生了抗癌作用的协同 效果。 通过小干扰 RNA(siRNA) 评价了 RM 干扰(RNA interference: RNAi)。通过RNAi敲除细胞内在细胞凋亡抑制中起作用 的分子Bel-2，诱导细胞凋亡。通过SPR监控此时线粒体极化状态的 变化，根据其变化率评价siRNA的有效性。对于Bel-2的通过siRNA 的细胞凋亡豫导，已经在Feng，L. F.等人的Bcl-2 induced apoptosis and increased sensitivity to 5-fluorouraci 1 and HCPT in HepG2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测活细胞中线粒体的极化状态变化的方法，其包括使用表面等离子体共振装置，检测该活细胞的线粒体的极化状态的变化所引起的表面等离子体共振角的变化的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：小名俊博，小齐平笃，
申请(专利权)人：国立大学法人九州大学，
类型：发明
国别省市：JP[日本]