一种胰腺癌化疗药疗效评价方法技术

本发明专利技术提供一种胰腺癌化疗药疗效评价方法，通过应用表面加强激光解吸电离－飞行时间质谱技术分析血清蛋白成分的差异，建立胰腺癌的血清蛋白质指纹图谱，应用ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ技术及生物信息学方法筛选出诊断效率高的胰腺癌肿瘤标志物，由二个质荷比位于３８７９Ｄａ、４７７２Ｄａ的血清蛋白质组成的质谱模型，为胰腺癌的药物治疗及预后评价提供客观有效的方法，具有较高的灵敏度、特异度和正确率。并且可以完善及改良蛋白质指纹图谱技术。本发明专利技术方法设计合理，是为降低我国胰腺癌的病死率、提高胰腺癌的治愈率、为评价胰腺癌药物疗效提供了一种新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物技术，涉及一种利用蛋白质组学检测胰腺癌化学治疗模型的 血清，从而评价胰腺癌化疗药疗效的方法。
技术介绍
胰腺癌以发病隐匿、恶性程度高、手术切除率低、预后极差为特征，是恶性程度最高的肿瘤之一。在我国现居癌症死亡率的第六位，其5年生存率仅为 1°/。-4%。手术根治是目前治疗胰腺癌唯一有确切疗效的方法，术后配合化疗， 其5年生存率可达15%-40%。但临床上只有10%-15%的病人可获行根治性切 除手术的机会，85%左右胰腺癌患者在确诊时已因出现转移等原因而失去手术 根治的机会。因此化疗在晚期胰腺癌治疗中有着不可取代的作用。吉西他滨已 作为治疗晚期胰腺癌化疗的"金标准"而被广泛接受。目前，对治疗胰腺癌的效果评价尚存在一定难度。虽然影像学技术可以提 供一定的帮助，但胰腺位于后腹膜，加上术后胰腺床改变，CT、 MRI等往往 难以精确分辨胰腺癌与正常组织界限和客观测量肿瘤大小，另外远处转移灶也 难以完全监测。目前临床受益疗效(clinicalbenefitresponse， CBR)包括腹痛、 体力状况、体重3个衡量指标趋向取代肿瘤大小成为主要的胰腺癌化疗指标， 但仍然缺乏如同肿瘤标志物的客观敏感性。目前比较普遍应用的血清肿瘤标志 物包括CA19-9、 CA50、 CEA等，虽有一定敏感性及特异性，但多用于早期发 现与诊断。迄今为止，尚未找到一种对治疗效果及预后有一定评价意义的指标。几年来，蛋白质组学己成为检测和筛查肿瘤标记物的重要手段之一。目前， 新型质谱技术以其高通量、高敏感性、采样便捷等优点广泛应用于肿瘤标记物 筛选的研究。表面加强激光解吸电离一飞行时间质谱技术是最近几年才发展起 来的一种新的蛋白组学研究方法，它能够直接自未经处理的生物样品获取蛋白 质图谱。以这一技术为基础开发的系列蛋白质芯片可以非特异性或特异性地结 合被测样本中的各种蛋白质，当在质谱仪中受到激光轰击时，各种结合蛋白质 会被激发而形成气化离子，由于不同质荷比(m/z)的离子在电场中飞行的时 间长短不一，因此接收装置可根据蛋白质质荷比的不同及量的多寡直观的用位置、强弱不同的峰表现出来，进而形成图谱用于分析。这一方，具有样品用量小，操作简便，灵敏度高，高通量等优点，可检测到fmol (10'15mol )数量级 的微量蛋白，并可一次性获得某一样品中成千上万个蛋白质数据。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用蛋白质组学检测胰腺癌化学治疗模型血清， 以获得一种提示胰腺癌化学治疗疗效的肿瘤标志物组合，为胰腺癌的药物治疗 及预后评价提供客观有效的方法。本专利技术应用表面加强激光解吸电离一飞行时 间质谱技术分析胰腺癌经吉西他滨治疗前后的血清蛋白成分的差异，建立胰腺 癌化疗的血清蛋白质指纹图谱，探索提示胰腺癌化学治疗疗效的肿瘤标志物组 合。具体通过以下步骤实现-(1) 制备血清样品取血清上清液，离心10分钟，取上清血清，在10)LdU9血清处理液中加入血清5pL，摇床上振荡使充分混合，用Binding Buffer (结 合缓冲液)将U9处理后的血清稀释至200W用于上样，取上述经U9处理并稀 释过的血清lOOpl加到CM10型蛋白质芯片上，芯片与血清充分反应1小时后 去除血清样品，每孔加入200pl相应的Binding Buffer,摇床上振荡5分钟 (600rpm，室温)后除去液体，重复该过程2次，用水(纯度HPLC级)20(^1快速 清洗每个孔1次，用力甩干并将Bio-Processor (96孔蛋白质芯片工作支架)倒 扣在清洁的吸水纸上轻拍以去除多余的水，将芯片从Bio-processor中取出，自 然干燥，每孔点加50%饱和的SPA (能量吸收分子)溶液lpl，待其自然干燥 后重复点加l次，自然干燥即可上机检测。(2) 利用表面加强激光解吸电离一飞行时间质谱技术(SurfanceEnhanced Laser Desorption / Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, SELDI-TOF-MS ) 检测步骤(l)的血清样本，获得血清蛋白质谱质谱仪参数设定:激光强度165， 灵敏度7，数据收集范围2000 — 30000m/z(蛋白质质量和电荷比值，即质荷比)， 每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正分子量。(3) 数据收集和生物信息学分析原始数据先以Proteinchip Software3.0 软件校正，使总离子强度及分子量达到均一，并过滤噪音，初始噪音过滤值5， 二次噪音过滤值2，以10%为最小阐值进行聚类。经上述数据预处理后， Mann-Whitney秩检验比较各组血清蛋白质质谱数据(由Proteinchip Software3.0 自带的Biomarker Wizard3.2.0软件完成)，寻找各组之间表达有差异的蛋白质 峰。各组血清蛋白质质谱比较的数据导入Matlab6.5数据处理软件的SVM、判 别分析软件。选择两组间差别最显著的10个蛋白质峰数据进行分析。筛选出Youden指数最高的秩和比峰组合，用SVM留一法和判别分析留一法建立分期 模型。每组分析样本设为n个，则所有样本中随机抽取n—l个样本设为训练 集用于建立模型，剩余1个样本设为测试集进行交叉验证。如此抽样、训练和 验证过程重复n次，以得到最接近真实值的结果。最后同时输出SVM、原始 判别及二者交叉验证的结果。并以SPSS13.0统计软件包进行统计分析，比较 不同蛋白质峰排列组合的判别分析结果，选出最佳排列组合；(4)结果表明质荷比分别为3879Da、 4772 Da的两个蛋白质峰值是否 升高可以准确判断经过化学治疗后肿瘤是否縮小，从而评价化疗药的疗效。本专利技术利用蛋白质组学检测胰腺癌化学治疗模型血清，以获得一种提示胰 腺癌化学治疗疗效的肿瘤标志物组合，为胰腺癌的药物治疗及预后评价提供客 观有效的方法，具有较高的灵敏度、特异度和正确率。并且可以完善及改良蛋 白质指纹图谱技术，降低检査费用，使之更适合于临床应用。为胰腺癌药物的 治疗评价提供动物实验基础。 附图说明图1为质核比(m/z)位于3879.胰腺癌模型组与吉西他滨组裸小鼠血清 蛋白质指纹图谱对比。图2为质核比(m/z)位于4772.胰腺癌模型组与吉西他滨组裸小鼠血清 蛋白质指纹图谱对比。 具体实施例方式本专利技术将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不 用于限制本专利技术范围。实施例l制备血清样品 主要仪器和试剂:CM10型蛋白质芯片 96孔蛋白质芯片工作支架即Bio-proeessor分析纯尿素、乙酸钠、乙睛、DTT和cHAPS缓冲盐(sigma公司) 能量吸收分子SPA、实施步骤分别取胰腺癌裸鼠全血及吉西他滨组裸鼠全血lml，在4度低 温离心(4000转/分钟)IO分钟，取上清液，再次离心10分钟，取上清血清。 10^1 U9血清处理液中加入血清5|iL，摇床上振荡使充分混合。用Binding Buffer 将U9处理后的血清稀释至200^1用于上样。取上述经U9处理并稀释过的血清100nl加到芯片上，芯片与血清充分反 应1小时后去除样品。每孔加入200|il相应的Binding Buffer,摇床上振荡5分钟(600rpm,室温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰腺癌化疗药疗效评价方法，其特征是通过以下步骤实现：　（１）血清样品制备：取上清血清加入Ｕ９血清处理液中，充分混合，再用结合缓冲液稀释，取稀释过的血清加到ＣＭ１０型蛋白质芯片上，充分反应后去除血清样品，每孔加入结合缓冲液，振荡后除去液体，用水清洗，甩干去除多余的水，取出芯片，自然干燥，每孔点加能量吸收分子溶液，自然干燥后即可上机检测；　（２）利用表面加强激光解吸电离－飞行时间质谱技术检测步骤（１）的血清样本，进行血清蛋白质谱数据收集，激光强度１６５，灵敏度７，数据收集范围２０００－３００００ｍ／ｚ，每次收集数据前以标准蛋白质芯片校正分子量；　（３）数据收集和生物信息学分析：由二个质荷比位于３８７９Ｄａ、４７７２Ｄａ的血清蛋白质组成的质谱模型，评价化疗药的疗效。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹利平，刘达人，汪亮，王贵锋，阙日升，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]