一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法技术

本发明专利技术属于生物技术和基因工程技术领域，具体方案是先利用大肠杆菌表达系统高效表达重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)，然后纯化蛋白和酶活性的测定。本发明专利技术构建的FLOD表达体系，提供了原核生物表达稳定性好的重组果糖赖氨酸氧化酶FLOD表达载体的构建方法，并将表达载体导入至大肠杆菌表达宿主中，经诱导发酵表达、两步纯化及鉴定后获得高纯度可溶性的目标重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)。本方法所采用的大肠杆菌表达系统，具有表达效率高、表达量大、成本低、易操作等特点，所表达的重组果糖赖氨酸氧化酶FLOD纯度高，温度和pH稳定性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法
本专利技术涉及基因工程
，具体是指一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法。
技术介绍
一项我国全国性的调查研究结果：目前中国的糖尿病患者已达到了9200万。这一数字使中国超越印度成为全球糖尿病人数最多的国家。而且，我国还有1.48亿糖尿病患者。作为一种慢性、终身性的疾病，糖尿病不仅会给患者带来生理和心理的痛苦，还会给国家和个人带来巨大的经济负担。随着糖尿病患者人数的增加，血糖检测的试剂也随之增加，降低血糖检测成本可缓解国家和患者的经济负担。人体内葡萄糖与血清蛋白N-末端可发生非酶促糖基化反应，且90％糖基化反应发生在血清蛋白第189位赖氨酸，形成高分子酮胺结构，总称为糖化血清蛋白。90％以上糖化血清蛋白是糖化血清白蛋白(GlycatedAlbumin，GA)，因此糖化血清白蛋白可反映糖化血清蛋白总体水平。糖化白蛋白是反映过去2-3周平均血糖水平的一项指标，比血糖检测“金标准”糖化血红蛋白周期短。果糖赖氨酸氧化酶催化糖化氨基酸变成葡萄糖酮醛、氨基酸和双氧水。在此催化反应液中，加入对白蛋白有特异性的蛋白酶，发生作用从糖化白蛋白(Glycatedalbumin)生成其次，注入糖化氨基酸氧化酶从糖化氨基酸生成葡萄糖酮醛、氨基酸和双氧水。双氧水在TOOS和4AAP的混合溶液中，定量地变化成蓝紫色色素。通过测定此蓝紫色色素的吸光度而定量从糖化白蛋白生成的糖化氨基酸。目前文献报道的果糖赖氨酸氧化酶大多酶活性和产量较低，很难实现工业化，亟待改进。专利
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术缺点，提供一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，所述表达方法包括重组表达载体构建、转化、目标蛋白诱导表达，步骤如下：(1)将FLOD基因插入到表达载体pET28a的多克隆位点，构建重组表达载体质粒pET28a-FLOD；(2)将(1)中构建的重组表达载体质粒转入宿主细胞E.coliBL21(DE3)，获得重组菌株；(3)对重组菌株进行诱导，表达FLOD蛋白。进一步的，所述FLOD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。进一步的，所述FLOD蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。进一步的，针对FLOD蛋白的纯化包括以下步骤：(4)诱导表达后收集菌体并破碎细胞后，高速离心获得细胞破碎液上清；(5)Ni-NTA树脂经过平衡液平衡后，将上清液过Ni-NTA树脂纯化，纯化后进行脱盐获得重组FLOD酶洗脱液；(6)脱盐后收集蛋白溶液，冻干处理，即得FLOD蛋白干粉。进一步的，步骤(5)所述平衡液组成为：25mMPBS，pH7.4，150mMNaCl，2mg/LFAD；进一步的，步骤(5)所述洗脱液组成为：20mMPBS，pH7.4，150mMNaCl，500mM咪唑，2mg/LFAD。本专利技术具有如下优点：本专利技术构建的FLOD表达体系，提供了原核生物表达稳定性好的重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)表达载体的构建方法，并将表达载体导入至大肠杆菌表达宿主中，经诱导发酵表达、两步纯化及鉴定后获得高纯度可溶性的目标重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)。本专利技术提供了一种活性稳定、表达量较高的工程菌株，纯化脱盐后的重组FLOD，可用于体外诊断试剂盒的开发。本方法所采用的大肠杆菌表达系统，具有表达效率高、表达量大、成本低、易操作等特点，所表达的重组果糖赖氨酸氧化酶(FLOD)纯度高，温度和pH稳定性好等优点。附图说明图1为工程菌菌落PCR验证图；图2为重组FLOD可溶性表达SDS-PAGE验证图；图3为重组FLOD纯化、脱盐后的SDS-PAGE验证图；图4为重组FLOD热稳定性实验；图5为重组FLOD在不同pH缓冲液中酶活性的测定；图6为重组FLOD与病人样本血清在生化仪中的反应图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明。本专利技术使用限制性内切酶购自北京索莱宝科技有限公司，Ni+树脂购自sigma，其他试剂未特别注明来源的均购自上海生工生物工程股份有限公司。基因及引物合成来自于北京生物工程生物科技有限公司。实验操作未详述的，均根据实验室手册——如《分子克隆》进行操作。其中，图1中M：1kbmarker；1：以NdeI-FLOD-F/XhoI-FLOD-R为引物进行PCR验证琼脂糖凝胶电泳图。其中，图2中M：蛋白marker，1：LB培养基发酵后破碎全菌；2：TB培养基发酵后破碎全菌；3：LB培养基发酵后破碎上清；4：TB培养基发酵后破碎上清。其中，图3中M：蛋白marker，1：1号工程菌纯化后样品；2：2号工程菌纯化后样品；3：1号工程菌脱盐后样品；4：2号工程菌脱盐后样品。重组FLOD表达和纯化：实施例1：pET28a-FLOD表达载体质粒及BL21-FLOD工程菌株的构建；(1)首先根据FLOD氨基酸序列(SEQIDNo.1)进行大肠杆菌表达密码子偏好性优化，并由基因公司合成获得FLOD基因片段，序列如SEQIDNo.2所示，目的片段两端酶切位点分别为NdeI和XhoI；(2)以包含合成基因的质粒为模板，用上、下游引物NdeI-FLOD-F(SEQIDNo.3)和XhoI-FLOD-R(SEQIDNo.4)将FLOD基因克隆，经琼脂糖凝胶电泳后，胶纯化回收PCR产物。用NdeI和XhoI分别双酶切pET28a表达载体质粒和FLOD基因PCR纯化回收产物，胶回收后用SolutionI连接酶将两片段连接。16℃反应4-6h后，连接产物加入到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，42℃反应1min30s，冰浴2min，加入1mLLB液体培养基，250rpm，37℃孵育1h。4000rpm离心收集菌体，去除800μL上清后重悬菌体，涂布卡那霉素抗性的LB培养基平板，37℃培养过夜。挑取单菌落至5mLLB液体培养基中，250rpm，37℃过夜培养。菌落PCR鉴定阳性克隆后进行测序分析，如图1所示。提取测序正确的阳性转化子质粒备用，命名为pET28a-FLOD。菌落PCR引物设计如下：上游引物NdeI-FLOD-F：GGAATTCCATATGATGGCTCCGTCTAAC(SEQIDNo.3)；下游引物引物XhoI-FLOD-R：CCGCTCGAGCAGCTGACCACGAGA(SEQIDNo.4)；(3)FLOD蛋白大肠杆菌表达菌株的获得：将测序正确的pET28a-FLOD表达载体质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，菌落PCR验证转化子，最终获得重组FLOD基因的大肠杆菌工程菌BL21-FLOD。实施例2：FLOD蛋白的诱导发酵表达、纯化及脱盐(1)FLOD蛋白的诱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，其特征在于，所述表达方法包括重组表达载体构建、转化、目标蛋白诱导表达，步骤如下：/n(1)将FLOD基因插入到表达载体pET28a的多克隆位点，构建重组表达载体质粒pET28a-FLOD；/n(2)将(1)中构建的重组表达载体质粒转入宿主细胞E.coliBL21(DE3)，获得重组菌株；/n(3)对重组菌株进行诱导，表达FLOD蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，其特征在于，所述表达方法包括重组表达载体构建、转化、目标蛋白诱导表达，步骤如下：
(1)将FLOD基因插入到表达载体pET28a的多克隆位点，构建重组表达载体质粒pET28a-FLOD；
(2)将(1)中构建的重组表达载体质粒转入宿主细胞E.coliBL21(DE3)，获得重组菌株；
(3)对重组菌株进行诱导，表达FLOD蛋白。


2.根据权利要求1所述的一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，其特征在于：所述FLOD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


3.根据权利要求1所述的一种重组FLOD蛋白的大肠杆菌表达方法，其特征在于：所述FLOD蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


4.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚金召，贺子桐，郑长龙，
申请(专利权)人：北京达成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11