一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法技术

本发明专利技术公开了一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。本发明专利技术发现在小麦成熟胚的组织培养过程中，添加一定浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以有效提高胚性愈伤组织诱导率和再生率；特别是在小麦成熟胚培养的预培养基中添加200μM的丁酸钠或0.5μM的曲古抑菌素A，可有效提高小麦材料CB037、Fielder和中国春的小麦成熟胚再生率。

【技术实现步骤摘要】
一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法
本专利技术涉及植物组织培养
，具体涉及一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法。
技术介绍
小麦(TriticumaestivumL.)是世界第一大口粮作物，约35％～40％的人以其为口粮。随着全球人口总量的不断增加和生物技术的不断发展，通过分子设计育种改良小麦的产量和品质等农艺性状已成为重要趋势。基因功能研究需要利用基因工程方法将外源基因导入小麦，而小麦组织培养的低再生频率是遗传转化的重要限制因素。目前，小麦遗传转化常用的外植体有幼胚、成熟胚、花药和幼穗等，其中，幼胚被认为是最理想的外植体，愈伤组织诱导率和植株再生率都比较高，获得转基因小麦植株的报道多以转化幼胚为主。但幼胚取材受时间和空间的限制，适宜的取材时间难以准确把握，在一定程度上制约了小麦遗传转化的规模化开展。成熟胚具有取材方便、不易受环境条件影响、个体间生理状态一致等优势，成为目前研究者进行突破的热点。但是，小麦成熟胚的组织培养比较困难，再生率比较低，能够用于遗传转化的基因型还很少。组蛋白修饰是表观遗传修饰的重要调控机制之一，包括组蛋白乙酰化、甲基化、泛素化及磷酸化等过程。其中，组蛋白乙酰化的过程是动态和可逆的，包括乙酰化和去乙酰化两个过程，分别由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)催化完成。研究表明HDACs在植物生长发育中发挥关键作用，其中包括花发育、种子发育、根发育以及器官生长过程中细胞的增殖和死亡等，同时响应生物和非生物胁迫，如干旱、盐胁迫、低温等。目前对植物中HDACs的功能研究主要集中在拟南芥等模式植物中，关于HDACs在小麦成熟胚组织培养中的研究尚未见报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法。本专利技术研究发现，在小麦成熟胚培养的预培养基中添加一定浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可有效提高胚性愈伤组织诱导率和再生率。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高小麦成熟胚的胚性愈伤组织诱导率和再生率中的应用。优选的，上述应用中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自曲古抑菌素A(TrichostatinA)或丁酸钠(sodiumbutyrate)。优选的，上述应用中，所述曲古抑菌素A的加入浓度为0.5μM，丁酸钠的加入浓度为200μM。本专利技术的第二方面，提供一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法，包括以下步骤：(1)对小麦种子进行预处理，将预处理后的小麦种子的成熟胚刮碎，接种于添加有组蛋白去乙酰化酶抑制剂的预培养基中，在黑暗、25℃条件下培养7天，得到小麦成熟胚愈伤组织；(2)将步骤(1)得到的小麦成熟胚愈伤组织转移到诱导培养基中，在黑暗、25℃条件下培养14天，得到胚性愈伤组织；(3)将步骤(2)得到的胚性愈伤组织转移到分化培养基中，在光照16小时/天、光强3500Lux、温度25℃条件下培养21天。优选的，步骤(1)中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自曲古抑菌素A或丁酸钠；所述曲古抑菌素A的加入浓度为0.5μM，丁酸钠的加入浓度为200μM。优选的，步骤(1)中，所述预培养基以MS基本培养基为基础，并添加有0.75g/LMgCl2、15.0g/L甘露醇、15.0g/L山梨醇、0.5g/L水解酪蛋白、10.0g/L葡萄糖、1.0mg/LB1维生素、0.5mg/LB3维生素、0.5mg/LB6维生素、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、78mg/L乙酰丁香酮、2.0mg/L2,4-D、5.0mg/LAgNO3、40.0mg/L半胱氨酸、100.0g/L维生素C和10g/L琼脂；pH5.8。优选的，步骤(2)中，所述诱导培养基以MS基本培养基为基础，并添加有1.0mg/LB1维生素、0.5mg/LB3维生素、0.5mg/LB6维生素、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、3.0％蔗糖、2.0mg/L2,4-D、5.0mg/LAgNO3和3.0g/L植物凝胶；pH5.8。优选的，步骤(3)中，所述分化培养基以MS基本培养基为基础，并添加有1.0mg/LB1维生素、0.5mg/LB3维生素、0.5mg/LB6维生素、2.0mg/L甘氨酸、5.0mg/L谷氨酰胺、2.0％蔗糖、0.2mg/LIAA和3.0g/L植物凝胶；pH5.8。优选的，所述小麦种子来自小麦材料CB037、Fielder或中国春。本专利技术的有益效果：本专利技术首次研究发现，在小麦成熟胚的组织培养过程中，添加一定浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以有效提高胚性愈伤组织诱导率和再生率；特别是在小麦成熟胚培养的预培养基中添加0.5μM的曲古抑菌素A或200μM的丁酸钠，可有效提高小麦材料CB037、Fielder和中国春的小麦成熟胚再生率。附图说明图1：曲古抑菌素A对小麦成熟胚再生率的影响，A、CB037于未添加曲古抑菌素A的培养基上培养(对照)；B、CB037在添加0.5μM曲古抑菌素A的培养基上培养；C、CB037在添加2.5μM曲古抑菌素A的培养基上培养；D、Fielder于未添加曲古抑菌素A的培养基上培养(对照)；E、Fielder在添加0.5μM曲古抑菌素A的培养基上培养；F、Fielder在添加2.5μM曲古抑菌素A的培养基上培养；G、中国春于未添加曲古抑菌素A的培养基上培养(对照)；H、中国春在添加0.5μM曲古抑菌素A的培养基上培养；I、中国春在添加2.5μM曲古抑菌素A的培养基上培养。图2：丁酸钠对小麦成熟胚再生率的影响；图中，A、CB037于未添加丁酸钠培养基上培养(对照)；B、CB037在添加200μM丁酸钠培养基上培养；C、CB037在添加1000μM丁酸钠培养基上培养；D、Fielder于未添加丁酸钠培养基上培养(对照)；E、Fielder在添加200μM丁酸钠培养基上培养；F、Fielder在添加1000μM丁酸钠培养基上培养；G、中国春于未添加丁酸钠培养基上培养(对照)；H、中国春在添加200μM丁酸钠培养基上培养；I、中国春在添加1000μM丁酸钠培养基上培养。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
部分介绍的，成熟胚具有取材方便、不易受环境条件影响、个体间生理状态一致等优势；但是，小麦成熟胚的组织培养比较困难，再生率比较低，能够用于遗传转化研究的小麦基因型还很少。基于此，本专利技术对如何提高小麦成熟胚组织培养过程中的再生率进行了深入研究。本专利技术研究发现，在小麦成熟胚培养的预培养基中添加一定浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以有效提高胚性愈伤组织诱导率和再生率。本专利技术进一步对组蛋白去乙酰化酶抑制剂的种类和加入浓度进行了优化考察，结果发现，在小麦成熟胚培养的预培养基中添加200μM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高小麦成熟胚的胚性愈伤组织诱导率和再生率中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在提高小麦成熟胚的胚性愈伤组织诱导率和再生率中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自曲古抑菌素A或丁酸钠。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述曲古抑菌素A的加入浓度为0.5μM，丁酸钠的加入浓度为200μM。


4.一种提高小麦成熟胚再生率的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对小麦种子进行预处理，将预处理后的小麦种子的成熟胚刮碎，接种于添加有组蛋白去乙酰化酶抑制剂的预培养基中，在黑暗、25℃条件下培养7天，得到小麦成熟胚愈伤组织；
(2)将步骤(1)得到的小麦成熟胚愈伤组织转移到诱导培养基中，在黑暗、25℃条件下培养14天，得到胚性愈伤组织；
(3)将步骤(2)得到的胚性愈伤组织转移到分化培养基中，在光照16小时/天、光强3500Lux、温度25℃条件下培养21天。


5.根据权利要求4所述的组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自曲古抑菌素A或丁酸钠；所述曲古抑菌素A的加入浓度为0.5μM，丁酸钠的加入浓度为200μM。


6.根据权利要求4所述的组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预培养基以MS基本培养基为基础，并添加有0.7...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宪省，别晓敏，李兴国，高新起，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37