一种基于气相色谱-质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种基于气相色谱‑质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法，其先向血清样品加入同位素正十九酸甲酯作为内标，然后经历甲酯化过程，再通过液‑液萃取法提取样品混合物中的中长链脂肪酸，使用Agilent DB‑23色谱将40种中长链脂肪酸分离后，采用内标标准曲线法进行串联质谱分析。具有选择性好、灵敏度高、分析时间短等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于气相色谱-质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法
本专利技术涉及代谢组学分析
，具体涉及一种基于气相色谱-质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法。
技术介绍
中长链脂肪酸不仅是能源物质，还是一种功能物质，通过对肠道菌群、肠道形态、免疫机能及Ghrelin分泌等机制影响人生长发育，其对人生长性能的影响的差异不仅与中长链脂肪酸的含量有关，还与所含中长链脂肪酸的种类及人所处的能量状态及人本身健康状况有关。此外，中长链脂肪酸的研究对防治慢性疾病有多种生理作用，对维持身体健康意义重大。目前采用GC-MS方法对中长链脂肪酸进行定量分析通常只能检测到少于37种常见中长链脂肪酸，对具有重要生理研究意义的二十二碳四烯酸C22:4、二十二碳五烯酸C22:5n-3和二十二碳五烯酸C22:5n-6三种不饱和长链脂肪酸无法实现分离检测，不利于科学研究的开展，以及成果的展示，故而需要一种新的检测方法以解决上述技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于气相色谱-质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法，其先向血清样品加入同位素正十九酸甲酯作为内标，然后经历甲酯化过程，再通过液-液萃取法提取样品混合物中的中长链脂肪酸，使用AgilentDB-23色谱将40种中长链脂肪酸分离后，采用内标标准曲线法进行串联质谱分析。具有选择性好、灵敏度高、分析时间短等优点。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：基于气相色谱-质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法，包括如下步骤：步骤S1配制内标溶液，称取同位素内标品正十九酸甲酯，加入正己烷溶解配制成内标溶液，备用；步骤S2配制系列浓度标准品混合溶液，称取甲酯化后的气相色谱-质谱(GC-MS)用的中长链脂肪酸标准品，使用正己烷配制成系列浓度梯度的标准品混合溶液；步骤S3样品萃取，取待检测血清样本，采用二氯甲烷和甲醇进行萃取提取样本的中长链脂肪酸，取二氯甲烷相，干燥；步骤S4添加内标，用正己烷复溶步骤S3种获得的样品，加入同位素正十九酸甲酯(C19:0)作为内标品，再加入氢氧化钾甲醇溶液处理，加水静置分层后取上清，氮气吹干，使用正己烷复溶，得样本提取溶液；步骤S5气相色谱-质谱分析，取步骤S2获得的系列浓度梯度的标准品混合溶液和步骤S4获得的样本提取溶液分别进行气相色谱分析，色谱温度梯度方式为：升温速率℃/min温度值℃停留时间min运行时间min起始温度7022程序120180815.5程序24250336气相色谱分离后的样品直接进入质谱分析；步骤S6浓度换算，将步骤S2获得的系列浓度梯度的标准品混合溶液的质谱数据绘制成标准曲线，将步骤S4获得的样本提取溶液的质谱数据通过标准曲线换算出对应中长链脂肪酸浓度。根据以上方案，所述的步骤S1中的内标溶液的正十九酸甲酯的浓度为1mg/mL。根据以上方案，所述的步骤S2中的系列浓度标准品溶液的浓度范围是1-2500mg/L。根据以上方案，所述的步骤S2中的中长链脂肪酸标准品包括如下标准品：丁酸甲酯、己酸甲酯、辛酸甲酯、癸酸甲酯、十一烷酸甲酯、月桂酸甲酯、十三烷酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、肉豆蔻烯酸甲酯、十五烷酸甲酯、十五碳烯酸甲酯、棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、十七烷酸甲酯、十七碳烯酸甲酯、硬脂酯酸甲酯、油酸甲酯、反油酸甲酯、亚油酸甲酯、反亚油酸甲酯、γ-亚麻酸甲酯、亚麻酸甲酯、花生酸甲酯、二十碳烯酸甲酯、二十碳三烯酸甲酯、二十碳三烯酸甲酯、花生四烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯、二十一烷酸甲酯、二十碳二烯酸甲酯、山嵛酸甲酯、芥酸甲酯、二十二碳二烯酸甲酯、二十二碳六烯酸甲酯、二十三烷酸甲酯、二十四烷酸甲酯、二十四碳烯酸甲酯、二十二碳四烯酸甲酯、二十二碳五烯酸甲酯和二十二碳五烯酸甲酯。根据以上方案，所述的步骤S3中萃取提取样本的中长链脂肪酸具体是：向待检测血清样本按体积比为二氯甲烷:甲醇＝2:1的比例加入二氯甲烷和甲醇，涡旋混匀1-3min；再摇床振荡15-30min，270rpm，25℃；再加入去离子水和无水硫酸钠，涡旋振荡2min；再以2000rpm离心4-6min；取下层二氯甲烷相，使用氮气吹干。根据以上方案，所述的步骤S4中添加内标详细步骤为：向步骤S3取得的样品中加入正己烷复溶后再加入同位素正十九酸甲酯(C19:0)，涡旋振荡1-3min，再加入0.4mol/L的氢氧化钾甲醇溶液，涡旋振荡1-3min，使用摇床以180rpm、37℃的条件振荡20-40min，再加入去离子水，涡旋振荡1-3min，静置分层后取上清至新的玻璃试管中，使用氮气吹干，再加入200μL正己烷，涡旋振荡2min，静置分层后取上清液。根据以上方案，所述的质谱分析中的中长链脂肪酸单离子检测扫描分组如下：所述的质谱分析中的中长链脂肪酸单离子检测扫描参数条件如下：分别对系列浓度梯度的标准品混合溶液和步骤S4获得的样本提取溶液进行分析，导出质谱数据进行处理。本专利技术的有益效果是：只需要简单的液-液萃取就可以完成样本的预处理步骤，同时通过一种同位素内标进行定量，能够准确检测血清中的重要中长链脂肪酸物质，方法精密度和准确度较高，可用于临床血清样本的定量分析，而且实验操作简单、实验周期短，为临床上中长链脂肪酸水平的健康评估提供了一种可靠的检测方法。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案进行说明。基于气相色谱-质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法，包括如下步骤：步骤S1配制内标溶液，称取100mg同位素内标品正十九酸甲酯，加入1ml正己烷溶解配制成100mg/mL的储备液，再取10μL储备液用正己烷稀释定容至1ml，制成1mg/mL内标溶液，备用；步骤S2配制系列浓度标准品混合溶液，称取甲酯化后的气相色谱-质谱(GC-MS)用的中长链脂肪酸标准品，使用正己烷配制成系列浓度梯度的标准品混合溶液，浓度包括2500、1000、500、250、125、62.5、25、10、5和1mg/L；所述的中长链脂肪酸标准品包括如下标准品：Methylbutyrate丁酸甲酯C4:0[623-42-7]2wt.％；Methylhexanoate己酸甲酯C6:0[106-70-7]2wt.％；Methyloctanoate辛酸甲酯C8:0[111-11-5]2wt.％；Methyldecanoate癸酸甲酯C10:0[110-42-9]4wt.％；Methylundecanoate十一烷酸甲酯C11:0[1731-86-8]2wt.％；Methyldodecanoate月桂酸甲酯C12:0[111-82-0]4wt.％；Methyltridecanoate本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于气相色谱-质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤S1配制内标溶液，称取同位素内标品正十九酸甲酯，加入正己烷溶解配制成内标溶液，备用；/n步骤S2配制系列浓度标准品混合溶液，称取甲酯化后的气相色谱-质谱用的中长链脂肪酸标准品，使用正己烷配制成系列浓度梯度的标准品混合溶液；/n步骤S3样品萃取，取待检测血清样本，采用二氯甲烷和甲醇进行萃取提取样本的中长链脂肪酸，取二氯甲烷相，干燥；/n步骤S4添加内标，用正己烷复溶步骤S3种获得的样品，加入同位素正十九酸甲酯作为内标品，再加入氢氧化钾甲醇溶液处理，加水静置分层后取上清，氮气吹干，使用正己烷复溶，得样本提取溶液；/n步骤S5气相色谱-质谱分析，取步骤S2获得的系列浓度梯度的标准品混合溶液和步骤S4获得的样本提取溶液分别进行气相色谱分析，色谱温度梯度方式为：/n

【技术特征摘要】
1.基于气相色谱-质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1配制内标溶液，称取同位素内标品正十九酸甲酯，加入正己烷溶解配制成内标溶液，备用；
步骤S2配制系列浓度标准品混合溶液，称取甲酯化后的气相色谱-质谱用的中长链脂肪酸标准品，使用正己烷配制成系列浓度梯度的标准品混合溶液；
步骤S3样品萃取，取待检测血清样本，采用二氯甲烷和甲醇进行萃取提取样本的中长链脂肪酸，取二氯甲烷相，干燥；
步骤S4添加内标，用正己烷复溶步骤S3种获得的样品，加入同位素正十九酸甲酯作为内标品，再加入氢氧化钾甲醇溶液处理，加水静置分层后取上清，氮气吹干，使用正己烷复溶，得样本提取溶液；
步骤S5气相色谱-质谱分析，取步骤S2获得的系列浓度梯度的标准品混合溶液和步骤S4获得的样本提取溶液分别进行气相色谱分析，色谱温度梯度方式为：












升温速率℃/min
温度值℃
停留时间min
运行时间min


起始温度

70
2
2


程序1
20
180
8
15.5


程序2
4
250
3
36






气相色谱分离后的样品直接进入质谱分析；
步骤S6浓度换算，将步骤S2获得的系列浓度梯度的标准品混合溶液的质谱数据绘制成标准曲线，将步骤S4获得的样本提取溶液的质谱数据通过标准曲线换算出对应中长链脂肪酸浓度。


2.根据权利要求1所述的基于气相色谱-质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法，其特征在于，所述的步骤S1中的内标溶液的正十九酸甲酯的浓度为1mg/mL。


3.根据权利要求1所述的基于气相色谱-质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法，其特征在于，所述的步骤S2中的系列浓度标准品溶液的浓度范围是1-2500mg/L。


4.根据权利要求1所述的基于气相色谱-质谱检测人血清内中长链脂肪酸的方法，其特征在于，所述的步骤S2中...

【专利技术属性】
技术研发人员：张赛，曾秋芳，杨超，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31