同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，具体公开一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法。本发明专利技术提供的PCR检测引物，可实现对猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒四种病毒的同时检测，与猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪博卡病毒、猪圆环病毒2型、猪德尔塔冠状病毒和猪伪狂犬病毒等其他猪源病毒无交叉扩增反应，特异性较强；且上述引物的灵敏度高，对PEDV、PRRSV、TGEV、PoRV最低检测浓度分别为9.12×10

【技术实现步骤摘要】
同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法。
技术介绍
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种高度接触性消化道传染病，以呕吐、水样腹泻和脱水为特征，OIE将其列为B类动物疫病。各年龄段的猪都易感，尤其是10日龄以内的仔猪发病率和病死率最高，多呈地方性流行，新发区可爆发性流行。猪繁殖与呼吸综合征是由猪蓝耳病毒，又称猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)引起的一种急性传染病，临床主要特征为流产、产死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困难等，在发病过程中会出现两耳皮肤发绀发紫，故又称为“蓝耳病”。猪流行性腹泻，英文缩写为PED(PorcineEpidemicDiarrhea)，是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种接触性肠道传染病，主要症状为呕吐、腹泻、脱水，临床变化和症状与猪传染性胃肠炎极为相似。在我多发生在每年的12月份至翌年1-2月份，夏季也有发病的报道，可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，病死率越高。轮状病毒病(RV)是由猪轮状病毒引起的猪急性肠道传染病，至今，在许多养猪国家均发现存在猪轮状病毒病。1974年由FLEWE等首次提出RV这个名称，并被国际病毒命名委员会采用。本病分布很广，几乎五大洲都有报道，能侵害人类和禽畜，并且感染率高、发病率高，对人类的健康和禽畜业的发展都有较大的危害，因此，逐渐引起了人们的广泛关注。上述四种猪急性肠道疾病临床症状相似，又易于混合感染，临床鉴别诊断非常困难。采用单一的PCR检测方法耗时长，因此，最近国内外开始研究多重PCR检测方法，但是现有的多重PCR检测方法假阳性率高、敏感性较低、精确度较差。因此，目前市面上急需一种可以准确、有效、更灵敏地针对猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒进行检测的产品。
技术实现思路
针对现有检测猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳病毒、流行性腹泻病毒和轮状病毒的方法存在的耗时长、特异性差、准确度低的问题，本专利技术提供一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物、试剂盒及其使用方法，其核苷酸序列为：PEDVP-F:5′-AAGGAGGTAACCGCACAGAAT-3′；PEDVP-R:5′-AAAATACATACGAAAGTAGAGCCTG-3′；PRRSVP-F:5′-AGGAGGTCCACAATAGCACAGA-3′；PRRSVP-R:5′-CAACTACCACCACAACACGAG-3′；TGEVP-F:5′-CTGTCCATCTAACTCAGAGGCAAAC-3′；TGEVP-R:5′-AACCACCTGAACACCACCAAG-3′；PoRVP-F:5′-GATGCGAAATCTGCTCAAACA-3′；PoRVP-R:5′-TCCAACCCAAAGTCCTTACAA-3′。相对于现有技术，本专利技术提供的PCR检测引物，可实现对猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒四种病毒的同时检测，与猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪圆环病毒2型、猪博卡病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪伪狂犬病毒等其他猪源病毒无交叉扩增反应，特异性较强；且上述引物的灵敏度高，对PEDV、PRRSV、TGEV、PoRV的最低检测浓度分别为9.12×10-5pg/μL、2.48×10-3pg/μL、7.55×10-5pg/μL、8.23×10-5pg/μL，检测准确率为100％。能够对PEDV、PRRSV、TGEV、PoRV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别，具有广阔的应用前景。本专利技术还提供了一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的试剂盒，包含上述引物。优选的，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、缓冲液和去离子水。更优选的，所述试剂盒包括上述引物，2×PCR扩增MIX和去离子水。本专利技术还提供上述试剂盒的使用方法，具体操作为：提取待测病毒的基因组为模板，用所述试剂盒进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。上述试剂盒的使用方法，耗时短、反应结果直观，可用于猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳病毒、流行性腹泻病毒和轮状病毒的同时快速检测。优选的，所述PCR扩增的体系包括以下试剂及用量：灭菌水3.3μL，2×PCR扩增MIX12.5μL，10μmol/L的PEDVP-F和10μmol/L的PEDVP-R引物各0.2μL，10μmol/L的PRRSVP-F和10μmol/L的PRRSVP-R引物各1.0μL，10μmol/L的TGEVP-F和10μmol/L的TGEVP-R引物各0.4μL，10μmol/L的PoRVP-F和10μmol/L的PoRVP-R引物各1.0μL和模板4.0μL。上述优选的反应条件可进一步提高猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳病毒、流行性腹泻病毒和轮状病毒四种病毒的检测效率。优选的，所述待测病毒的基因组的提取采用基因组提取试剂盒提取。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。为了更好的说明本专利技术实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。实施例1引物设计：根据Genbank中登录的PEDV的MK841495基因、PRRSV的AY150312基因、TGEV的AF209745基因、PORV的MF278302基因序列，分别设计引物，设计的引物序列如表1所示，由上海生工生物工程有限公司合成。表1筛选的用于PCR反应的引物实施例2多重PCR检测方法：(1)基因组的提取：按照双螺旋公司动物基因组DNA/RNA提取试剂盒操作说明书提取病毒基因组，-20℃保存备用；(2)反转录(cDNA的合成)配制反转录反应体系，每管加入RNA模板16μL和4μL5×RNA反转录反应混合液(含Buffer、dNTP、M-MLV、RNA酶抑制剂、通用反转录引物等)，37℃水浴15min，反应结束后，经85℃灭活反转录酶，得到cDNA，备用；(3)高通量PCR扩增在PCR反应管中分别加入灭菌水3.3μL，2×PCR扩增MIX12.5μL，猪传染性胃肠炎病毒上、下游引物(10μmol/L)各0.2μL，猪蓝耳病毒上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL，猪流行性腹泻病毒上、下游引物(10μmol/L)各0.4μL，猪轮状病毒上、下游引物(10μmol/L)各1.0μL，cDNA4.0μL，共25μlRT-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物，其特征在于，其核苷酸序列为：/nPEDV P-F:5′-AAG GAG GTA ACC GCA CAG AAT-3′；/nPEDV P-R:5′-AAA ATA CAT ACG AAA GTA GAG CCT G-3′；/nPRRSV P-F:5′-AGGAGGTCCACAATAGCACAGA-3′；/nPRRSV P-R:5′-CAACTACCACCACAACACGAG-3′；/nTGEV P-F:5′-CTG TCC ATC TAA CTC AGA GGC AAA C-3′；/nTGEV P-R:5′-AAC CAC CTG AAC ACC ACC AAG-3′；/nPoRV P-F:5′-GAT GCG AAA TCT GCT CAA ACA-3′；/nPoRV P-R:5′-TCC AAC CCA AAG TCC TTA CAA-3′。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的引物，其特征在于，其核苷酸序列为：
PEDVP-F:5′-AAGGAGGTAACCGCACAGAAT-3′；
PEDVP-R:5′-AAAATACATACGAAAGTAGAGCCTG-3′；
PRRSVP-F:5′-AGGAGGTCCACAATAGCACAGA-3′；
PRRSVP-R:5′-CAACTACCACCACAACACGAG-3′；
TGEVP-F:5′-CTGTCCATCTAACTCAGAGGCAAAC-3′；
TGEVP-R:5′-AACCACCTGAACACCACCAAG-3′；
PoRVP-F:5′-GATGCGAAATCTGCTCAAACA-3′；
PoRVP-R:5′-TCCAACCCAAAGTCCTTACAA-3′。


2.一种同时检测PEDV、PRRSV、TGEV和PoRV的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、缓冲液和去离子水。


4.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李清扬，李一鸣，焦义然，张婵，石磊，时国强，范葶莉，李翀，王琨，
申请(专利权)人：河北三狮生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13