一种刺参养殖用益生菌组合物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种刺参养殖用益生菌组合物及其应用，属于微生物制剂技术领域，所述组合物包括副干酪乳杆菌CSDN‑6、植物乳杆菌CLY‑5和贝莱斯芽孢杆菌DY‑6，3株菌以菌体数量比1:1:1混合，其中副干酪乳杆菌CSDN‑6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CGMCC No.19756。本发明专利技术组合物对刺参重要疾病“腐皮综合征”中的2种致病菌灿烂弧菌(V.splendidus)及假交替单胞菌(P.nigrifaciens)具有拮抗作用，能够有效的预防疾病的发生。本发明专利技术的益生菌能够提高刺参的非特异性免疫力，增强刺参的抵抗力，有效预防疾病发生。

【技术实现步骤摘要】
一种刺参养殖用益生菌组合物及其应用
本专利技术涉及微生物制剂
，具体涉及一种刺参养殖用益生菌组合物及其应用。
技术介绍
近年来，我国刺参养殖业蓬勃发展，已成为我国沿海重要的养殖品种，随着养殖技术提升，刺参养殖的集约化程度越来越高，养殖密度和产量也随之升高，养殖系统内的有机物不断增加，从而导致养殖环境中细菌滋生、水质败坏等现象，由此引发的刺参病害问题日趋严重。目前，危害最为严重的是刺参“腐皮综合征”，由于该病感染速度快、死亡率高，成为制约该产业发展的重要瓶颈。对刺参“腐皮综合征”的病原学研究表明该疾病主要致病菌包括假交替单胞菌(Pseudoalteromonasnigrifaciens)和灿烂弧菌(Vibriosplendidus)等。目前，养殖产业中大多采用抗生素等化学类药物对疾病进行防治，且多数养殖者为了预防该病的发生，在养殖前还利用消毒剂对池塘进行消毒。长期使用抗生素和消毒剂不仅对环境造成巨大的影响，而且会诱导病原菌产生耐药性并导致养殖环境微生物的生态平衡失调，还会对食品安全造成潜在威胁。随着益生菌筛选及应用相关研究的进展，以益生菌为主的微生态制剂产品在疾病防控中表现出了绿色、高效的特点，成为进行绿色防控病害的重要途径。虽然我国近年来开发了很多微生态制剂产品，但多数微生态制剂菌种从国外或畜牧业引入，对水产养殖环境不适应，难以快速繁殖；没有对抑制海参疾病的致病原、提高海参免疫力的相关数据分析基础户。因此，针对海参池塘病害频繁的现象，研发具有多功能益生菌组合的微生态制剂，对海参健康养殖有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种海参养殖用益生菌组合物及其应用，所述组合物对刺参具有抗菌、增强免疫和促进生长等作用，可减少养殖过程中抗生素、消毒剂等药物的使用。本专利技术的海参养殖用益生菌组合物能够抑制刺参重要的病原菌、增强刺参的非特异性免疫力、提高刺参的增重率等多种功能，对刺参疾病的防控有重要意义。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供了一种刺参养殖用益生菌组合物，所述组合物包括副干酪乳杆菌CSDN-6、植物乳杆菌CLY-5和贝莱斯芽孢杆菌DY-6，根据3株菌规模化培养液中的菌落浓度进行配比和稀释，使组合物总菌落浓度为5.0×109CFU/ml，各菌株细菌数的比例为1:1:1；所述副干酪乳杆菌CSDN-6保藏于2020年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为副干酪乳杆菌Lactobacillusparacasei，保藏号为CGMCCNo.19756。本专利技术提供的益生菌组合物可有效抑制刺参腐皮综合征重要致病原灿烂弧菌(V.splendidus)和假交替单胞菌(P.nigrifaciens)。本专利技术还提供含有所述副干酪乳杆菌CSDN-6、植物乳杆菌CLY-5和贝莱斯芽孢杆菌DY-6的益生菌组合物提高刺参免疫力、促进刺参生长功能的应用，使用终浓度为1×103CFU/mL。本专利技术与现有技术相比的有益效果：1.本专利技术组合物对刺参重要疾病“腐皮综合征”中的2种致病菌灿烂弧菌(V.splendidus)及假交替单胞菌(P.nigrifaciens)具有拮抗作用，能够有效的预防疾病的发生。2.本专利技术组合物所包含的3株益生菌均为分离自刺参养殖环境中的原籍益生菌，能够快速适应外界环境，并快速繁殖形成优势细菌。3.本专利技术的益生菌组合物能够提高刺参的非特异性免疫力，增强刺参的抵抗力，有效预防疾病发生。4.本专利技术的益生菌组合物能够促进养殖刺参的增重率，提高养殖效益。附图说明图1、基于菌株CSDN-616SrDNA序列构建的系统发育树；图2、基于菌株CLY-516SrDNA序列构建的系统发育树；图3、基于菌株DY-616SrDNA序列构建的系统发育树；图4、CSDN-6菌株的生长曲线；图5、CLY-5菌株的生长曲线；图6、DY-6菌株的生长曲线；图7、不同实验组中刺参非特异性免疫酶ACP的酶活；图8、不同实验组中刺参非特异性免疫酶AKP的酶活；图9、不同实验组中刺参非特异性免疫酶SOD的酶活。具体实施方式实施例1益生菌的筛选与益生菌组合物的制备1.1菌株的筛选利用TSB培养基和MRS培养基对刺参底泥中的细菌进行培养，并通过形态学分离获得细菌菌株，以刺参“腐皮综合征”2种重要致病菌灿烂弧菌(V.splendidus)及假交替单胞菌(P.nigrifaciens)为指示菌，测定细菌菌株对指示菌的抑制效果，从而筛选出具有拮抗病原菌的菌株。通过对指示菌的拮抗实验筛选出3株具有显著拮抗作用的菌株CSDN-6、DY-6和CLY-5，其中CSDN-6和CLY-5菌株分离自MRS培养基，菌株DY-6分离自TSB培养基。CSDN-6菌落表面光滑，有光泽，中央隆起，边缘清晰。革兰氏染色阳性，无鞭毛，无芽孢。DY-6菌落粗糙有褶皱，不透明，扩张，污白色或淡黄色。革兰氏染色阳性，周生鞭毛。CLY-5菌株表面光滑，有光泽，中央隆起，不透明，乳白色或淡黄色，具有酸味。革兰氏染色阳性，无鞭毛，无芽孢。1.2菌株对刺参的安全性评价利用MRS液体培养基培养CSDN-6和CLY-5，利用TSB液体培养基培养DY-6。通过细菌高浓度胁迫实验测试筛选菌株对刺参的安全性，测定3株菌及以3株菌以菌体数量1:1:1组成的混合物对刺参的安全性。实验用健康刺参规格为15～20g/头。刺参在暂养7d后随机分组，每组20头，每个水槽定量加水20L。实验分实验组和空白对照组，每组设3个平行，其中实验组采用浸浴的方式，浸浴浓度设置1×107CFU/mL、1×108CFU/mL和1×109CFU/mL3个实验梯度，实验共进行30d，每天观察并记录刺参的活力、体色、摄食、排便、病征及死亡等情况。实验结果表明：整个实验过程中刺参健康，活力良好，摄食正常，无发病和死亡现象，说明筛选的3株菌以及3株菌以菌体数量1:1:1组成的组合物对刺参都是安全的。1.3菌株的生理生化鉴定参照麦氏比浊法制备0.5麦氏浊度的菌悬液，以细菌微量检定管进行生理生化指标的测定。参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》(凌代文等，1999)进行归类判定。菌株CSDN-6能分解利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇；3％NaCl尿素酶、3％NaClONPG、苦杏仁苷、丙二酸盐呈阳性，氧化酶反应呈阴性，不液化明胶，不产生H2S气体，主要生理生化特征见表1。参照《常见细菌系统鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中乳杆菌属的特征，对菌株CSDN-6进行分类地位的鉴定，初步鉴定筛选菌株属于乳杆菌科(Lactobacillaceae)。表1菌株CSDN-6的生理生化特征注：﹢表示阳性，﹣表示阴性菌株DY-6能分解利用葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖；水解鸟氨酸脱羧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海参养殖用益生菌组合物，其特征在于所述组合物包括副干酪乳杆菌CSDN-6、植物乳杆菌CLY-5和贝莱斯芽孢杆菌DY-6，组合物总菌落浓度为5.0×10

【技术特征摘要】
20200507 CN 20201037778071.一种海参养殖用益生菌组合物，其特征在于所述组合物包括副干酪乳杆菌CSDN-6、植物乳杆菌CLY-5和贝莱斯芽孢杆菌DY-6，组合物总菌落浓度为5.0×109CFU/ml，各菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖梅杰，王印庚，李彬，张永刚，刘红强，荣小军，张正，于永翔，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37