一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法，及该材料在含有磷酸化肽的样品中，富集磷酸化肽的应用。制备方法包括以下步骤：(1)将含有机膦酸功能化离子液体的三足螯合结构修饰到基底材料上；(2)将金属离子结合到含有机膦酸功能化离子液体的三足螯合结构上。本发明专利技术制备的功能化材料具有大的比表面积，更好的亲水性、固定金属离子的能力、耐酸碱性和稳定性，对磷酸化肽具有良好的特异选择性结合，适合于复杂生物样品的磷酸化肽的富集纯化。该材料在生物医学领域具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用
本专利技术属于功能材料、生命科学领域，具体涉及一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料，同时还涉及该材料的制备方法及其应用。
技术介绍
自从蛋白质组学建立以来，开启了生命科学研究发展的新阶段。蛋白磷酸化/去磷酸化作为一种重要的翻译后修饰过程，据报道超过50％的蛋白质在他们的生命周期中是磷酸化的。蛋白质磷酸化是生物体内普遍存在的重要调节机制之一，与细胞的新陈代谢、增殖、凋亡，信号传导、分子识别等密切相关(T.E.Thingholm,O.N.Jensen,M.R.Larsen,Proteomics2009,9,1451-1468.)。对蛋白磷酸化的充分认识，对疾病诊断学和病理学研究，以及寻找生物标志物，开发新药具有重要意义。磷酸化蛋白降解可以得到多种磷酸化多肽。因此，分离和鉴定磷酸化多肽具有重要意义。质谱技术的发展，使得质谱在蛋白组学研究中应用越来越广泛(X.S.Li,B.F.Yuan,Y.Q.Feng,Trac-TrendAnalChem2016,78,70-83.)。然而，蛋白质磷酸化的动态可逆性、瞬时性，以及磷酸化多肽的低丰度、低离子化效率，使得相关检测困难。因此，在质谱分析前，对样品中磷酸化肽的富集，是获得有效检测的关键。金属离子固定化亲和色谱(immobilizedmetalionaffinitychromatography,IMAC)材料，是近些年来发展起来最快一类富集材料。但现有IMAC材料仍然存在这抗干扰性不够强、特异性不够强、检测灵敏度不够高，材料重复使用性不够好，成本偏高等缺陷。
技术实现思路
基于现有技术中所存在的问题，本专利技术引入一种有机膦功能化离子液体(PFIL)，通过季胺化反应，获得有机膦酸基团功能化的三足螯合配体，并将其修饰在基底材料的表面。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决。一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料，该材料通过以下方法制备：(1)将基底材料B分散在无水甲苯中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，并进行搅拌、加热，得到氨基修饰的纳米材料，即B-NH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为以下六种中任意一种：G@nSiO2、G@mSiO2纳米复合物、nSiO2、mSiO2纳米颗粒、Fe3O4@nSiO2、Fe3O4@nSiO2@mSiO2磁性纳米颗粒；(2)将上述得到的材料B-NH2分散于无水甲苯中，然后向其中加入二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，搅拌、加热后，材料B-NH2表面的氨基被季胺化，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到有机膦酸基团修饰的纳米材料(B-NH2-PFIL)；(3)将得到的材料B-NH2-PFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；(4)将步骤(3)得到的材料分散于金属盐溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即B-NH2-PFIL-Mn+，也即三足离子液体材料。一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料的制备方法，包括以下步骤：(1)将基底材料B分散在无水甲苯中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，并进行搅拌、加热，得到氨基修饰的纳米材料，即B-NH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为以下六种中任意一种：G@nSiO2、G@mSiO2纳米复合物、nSiO2、mSiO2纳米颗粒、Fe3O4@nSiO2、Fe3O4@nSiO2@mSiO2磁性纳米颗粒；(2)将上述得到的材料B-NH2分散于无水甲苯中，然后向其中加入二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，搅拌、加热后，材料B-NH2表面的氨基被季胺化，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到有机膦酸基团修饰的纳米材料(B-NH2-PFIL)；(3)将得到的材料B-NH2-PFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；(4)将步骤(3)得到的材料分散于金属盐溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即B-NH2-PFIL-Mn+，也即三足离子液体材料。进一步的，所述步骤(1)中，反应的温度为110℃，反应时间为24h。进一步的，所述步骤(2)中，反应的温度为85℃，反应时间为12h。进一步的，所述步骤(1)和(2)中洗涤液均为乙醇。本申请中的三足离子液体材料在富集磷酸化肽中的应用：将上述三足离子液体材料用于富集磷酸化肽。本专利技术的原理如下：本专利技术通过将氨基化纳米材料的氨基季胺化，得到三足有机膦功能化离子液体修饰的纳米材料，即B-NH2-PFIL；在酸化处理后，继而在有机膦酸基团上修饰金属离子，得到B-NH2-PFIL-Mn+固定金属离子亲和色谱材料。本专利技术通过改变基底材料B，制备了六种不同基底材料的IMAC吸附剂，即B-NH2-PFIL-Mn+(其中，B＝G@nSiO2或G@mSiO2或nSiO2或mSiO2或Fe3O4@nSiO2或Fe3O4@nSiO2@mSiO2)。本专利技术具有以下优点和优异特性：(1)本专利技术的修饰方法简单，易于操作，并且不会破坏基底材料的基本形貌特征，三足螯合结构有强的络合金属离子能力；制备得到的亲和材料，具有良好的稳定性，耐酸碱性，增加了该材料的实用性。(2)本专利技术中所合成的固定金属离子亲和材料—B-NH2-PFIL-Mn+作为IMAC吸附剂，利用金属离子和磷酸化肽中磷酸基团间的亲和性，具有良好的特异选择性，可用于磷酸化肽的特异性富集，并且成功地将合成的材料用于标准肽、多肽混合液以及人类唾液样品中磷酸化肽的富集。附图说明图1为B-NH2-PFIL-Mn+(以nSiO2-NH2-PFIL-Ti4+为例)的合成流程图。类似地，利用其它基底材料制备得到对应的IMAC吸附剂。图2为β-酪蛋白酶解液的质谱图；其中，图2a为β-酪蛋白酶解液的直接检测图；图2b为β-酪蛋白酶解液经过G@nSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2c为β-酪蛋白酶解液经过G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2d为β-酪蛋白酶解液经过nSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2e为β-酪蛋白酶解液经过mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2f为β-酪蛋白酶解液经过Fe3O4@nSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2g为β-酪蛋白酶解液经过Fe3O4@nSiO2@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。图3为β-酪蛋白酶解液用G@mSiO2-NH2-PFIL-Zr4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。图4为β-酪蛋白和牛血清蛋白BSA的酶解混合液(摩尔比为1：1000)的质谱图；其中，图4a为G@mSiO2-NH2-PFIL-Zr4+处理后的质谱图；图4b为G@mSiO2-NH2-PFIL-Ti4+处理后的质谱图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料，其特征在于，该材料通过以下方法制备：/n(1)将基底材料B分散在无水甲苯中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，并进行搅拌、加热，得到氨基修饰的纳米材料，即B-NH

【技术特征摘要】
1.一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料，其特征在于，该材料通过以下方法制备：
(1)将基底材料B分散在无水甲苯中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，并进行搅拌、加热，得到氨基修饰的纳米材料，即B-NH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为以下六种中任意一种：G@nSiO2、G@mSiO2纳米复合物、nSiO2、mSiO2纳米颗粒、Fe3O4@nSiO2、Fe3O4@nSiO2@mSiO2磁性纳米颗粒；
(2)将上述得到的材料B-NH2分散于无水甲苯中，然后向其中加入二乙基(3-溴丙基)膦酸酯，搅拌、加热后，材料B-NH2表面的氨基被季胺化，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到有机膦酸基团修饰的纳米材料(B-NH2-PFIL)；
(3)将得到的材料B-NH2-PFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；
(4)将步骤(3)得到的材料分散于金属盐溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即B-NH2-PFIL-Mn+，也即三足离子液体材料。


2.一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将基底材料B分散在无水甲苯中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，并进行搅拌、加热，得到氨基修饰的纳米材料，即B-NH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为以下六种中任意一种：G@nSiO2、G@mSiO2纳米复合...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌斌，梁洪泽，蒋雨菲，梁炜达，刘彬，蒋银丽，林嘉宇，卢俐衡，桑坤明，黎思蕴，闫迎华，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33