检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及其应用，属于有害微生物检测技术领域。本发明专利技术的生物传感器，是由鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体修饰的碳量子点Td‑CD和鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体修饰的磁珠Td‑MB组成；其中，所述的鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体是通过序列设计与其他核酸组装形成DNA正四面体结构后，再分别用于修饰碳量子点和磁珠。采用本发明专利技术生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法操作简便，用时短，无需对待测样本进行复杂的前处理，检测成本低；本发明专利技术生物传感器能够有效放大鼠伤寒沙门氏菌的信号，可用于食品中低浓度的鼠伤寒沙门氏菌检测，实现对鼠伤寒沙门氏菌的定性和定量分析。

【技术实现步骤摘要】
检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及其应用
本专利技术属于有害微生物检测
，具体涉及一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器及其应用。
技术介绍
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)是一种常见的食源性致病菌，是革兰氏阴性厌氧菌，广泛存在于食物、水源和动植物上，受污染的食物和水会引起哺乳动物和人类胃肠炎。感染鼠伤寒沙门氏菌引发的常见的症状包括高烧、咳嗽、腹泻、腹部痉挛和呕吐，重病可导致死亡，造成食品安全和人类健康的巨大损失。因而准确识别和检测鼠伤寒沙门氏菌尤为重要。目前，检测鼠伤寒沙门氏菌的方法有生物学分离培养法，酶联免疫分析法，PCR分子检测法等。传统的生物学分离培养法可以得到准确的检测结果，但其检测过程耗时长，需要四至七天。酶联免疫分析法检测特异性高，方便快速，但检测过程极易受pH变化和环境温度等影响，且灵敏度较低，难以达到对鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度要求。PCR分子检测方法价格昂贵，对操作的专业性要求高，难以满足实际检测要求。因此，提供一种灵敏、快速、准确率高的鼠伤寒沙门氏菌检测方法具有重要意义食品样品组成复杂，因此鼠伤寒沙门氏菌在食品中的检测很容易受食品基质的干扰影响。针对于此，磁分离技术是一种很好的方法，它通过磁性微球上偶联特异性识别分子与食品中存在的致病菌发生特异性结合，形成的复合物在磁力作用下与其它杂质分离，以快速富集致病菌。核酸适配体(aptamer)是一段被筛选出来的DNA或者RNA序列，也被称为“化学抗体”，作为新一代识别分子，其分子量较低(15-50碱基)，核酸适配体具有与蛋白类抗体相当甚至更高的亲和性，而且与传统的生物学方法获得的抗体相比，具有易合成和易储存的优点，因其特异性强、对生物分子的亲和力高、稳定性好、没有免疫原性和毒性而被广泛应用于识别和检测。DNA正四面体结构是通过四条不同的核酸组装而形成的性质优异的DNA纳米结构，通过序列设计将核酸适配体与其他3条核酸组装即可形正四面体核酸适配体，这种结构可以克服核酸适配体柔软不易固定的缺点。量子点尺寸小，荧光强度高、斯托克斯位移大、抗光漂白、长荧光寿命和良好的生物相容性方面优于其它发光材料，自从20年前作为活细胞的生物发光标记以来，引起了人们的高度关注。将DNA正四面体结构修饰在量子点表面，可以提高检验的准确度和灵敏度。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的第一个目的是设计合成DNA正四面体核酸适配体纳米结构用于鼠伤寒沙门氏菌的特异性、高效识别；本专利技术的第二个目的是合成无毒碳纳米量子点，建立基于碳量子点自组装微球的信号放大方法，提高对鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度；本专利技术的第三个目的是制备一种以DNA正四面体核酸适配体纳米结构为信号识别器，自组装碳量子点微球为信号放大器的磁分离量子点荧光夹心传感器，以及使用该传感器对鼠伤寒沙门氏菌进行检测的方法，以解决现有检测鼠伤寒沙门氏菌技术中存在的灵敏度低、检测方法繁琐、仪器设备要求高等问题。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，是由鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体修饰的碳量子点Td-CD和鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体修饰的磁珠Td-MB组成；其中，所述的鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体是通过序列设计与其他核酸组装形成DNA正四面体结构后，再分别用于修饰碳量子点和磁珠，用于修饰碳量子点的鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体DNA正四面体结构为Td-Aptamer1，用于修饰磁珠的鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体DNA正四面体结构为Td-Aptamer2。在上述方案的基础上，所述形成Td-Aptamer1的核酸序列为：A1链：5′-ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTACTGACAGATTAAAAGTGGTTGGGCAACTTCTGCTTGCGAA-3'(SEQIDNO:1)B链：5′-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3'(SEQIDNO:3)，5′末端连接生物素biotin分子；C链：5′-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3'(SEQIDNO:4)，5′末端连接生物素biotin分子；D链：5′-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3'(SEQIDNO:5)，5′末端连接生物素biotin分子。所述形成Td-Aptamer2的核酸序列为：A2链：5′-ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3’(SEQIDNO:2)；B链：5′-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3'(SEQIDNO:3)，5′末端连接生物素biotin分子；C链：5′-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3'(SEQIDNO:4)，5′末端连接生物素biotin分子；D链：5′-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3'(SEQIDNO:5)，5′末端连接生物素biotin分子。在上述方案的基础上，所述Td-Aptamer1和Td-Aptamer2的制备方法为：将DNA正四面体结构的四条核酸序列分别等摩尔混合溶于TE缓冲溶液中，涡旋混匀后的溶液加热到95℃5min，在冰水中快速冷却10min至4℃，即得。在上述方案的基础上，所述鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体修饰的碳量子点Td-CD的制备方法为：将Td-aptamer1和链霉亲和素-碳量子点SA-CDs按照摩尔比4:1加入PBS缓冲液中，室温下剧烈震荡1h，转速5000rpm，离心10min，弃上清液，即得Td-CD微球，并将其分散于PBS缓冲液中得到Td-CD溶液。在上述方案的基础上，所述链霉亲和素-碳量子点SA-CDs的制备方法为：称取5mg氨基功能化碳量子点溶解于1.5mL无水乙醇中超声分散均匀，向其中滴加链霉亲和素溶液，待超声15min后于室温下剧烈震荡3h，转速12,000rpm，离心20min，弃上清液，得到链霉亲和素修饰的碳量子点。在上述方案的基础上，所述氨基功能化碳量子点的制备方法为：称取0.4gβ-环糊精溶于20mL超纯水中超声分散均匀，将其转入以聚四氟乙烯为内衬的不锈钢高压反应釜中，置于鼓风式加热干燥箱中，于200℃温度下水热反应6h；待反应结束后自然冷却至室温，将所得黄褐色透明液体用透本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，其特征在于，是由鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体修饰的碳量子点Td-CD和鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体修饰的磁珠Td-MB组成；/n其中，所述的鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体是通过序列设计与其他核酸组装形成DNA正四面体结构后，再分别用于修饰碳量子点和磁珠，用于修饰碳量子点的鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体DNA正四面体结构为Td-Aptamer1，用于修饰磁珠的鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体DNA正四面体结构为Td-Aptamer2。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，其特征在于，是由鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体修饰的碳量子点Td-CD和鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体修饰的磁珠Td-MB组成；
其中，所述的鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体是通过序列设计与其他核酸组装形成DNA正四面体结构后，再分别用于修饰碳量子点和磁珠，用于修饰碳量子点的鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体DNA正四面体结构为Td-Aptamer1，用于修饰磁珠的鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体DNA正四面体结构为Td-Aptamer2。


2.根据权利要求1所述检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，其特征在于，
所述形成Td-Aptamer1的核酸序列为：
A1链：5′-ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTACTGACAGATTAAAAGTGGTTGGGCAACTTCTGCTTGCGAA-3'
B链：5′-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3'，5′末端连接生物素biotin分子；
C链：5′-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3'，5′末端连接生物素biotin分子；
D链：5′-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3'，5′末端连接生物素biotin分子。
所述形成Td-Aptamer2的核酸序列为：
A2链：5′-ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3’；
B链：5′-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3'，5′末端连接生物素biotin分子；
C链：5′-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3'，5′末端连接生物素biotin分子；
D链：5′-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3'，5′末端连接生物素biotin分子。


3.根据权利要求2所述检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器，其特征在于，所述Td-Aptamer1和Td-Aptamer2的制备方法为：将DNA正四面体结构的四条核酸序列分别等摩尔混合溶于TE缓冲溶液中，涡旋混匀后的溶液加热到95℃5min，在冰水中快速冷却10min至4℃，即得。

【专利技术属性】
技术研发人员：吴薇，杨庆利，都晗，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37