【技术实现步骤摘要】
一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法及其应用
本专利技术涉及外泌体检测
，具体为一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法及其应用。
技术介绍
外泌体是一种纳米大小的小囊泡,被体内大多数细胞类型分泌,因为外泌体可以从循环体液中提取出来,他们可以作为神经疾病状态的一个潜在生物标记物.外泌体已经被证明可以在细胞间传播毒性Aβ(β-淀粉样蛋白)和高度磷酸化的tau蛋白，在阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，以下简称为AD)中导致神经元的丢失。同时，在电镜和NTA下，可以看到与年龄匹配的正常人相比，AD血浆来源的神经元外泌体的形态和数量将会发生变化。在这篇文章中，我们主要用ELISA的方法来检测AD病人和年龄匹配的正常人血浆来源的神经外泌体中Totaltau,P-S396-tau和β-amyloid1-42(Aβ1-42)水平的变化，以及在TEM和NTA下外泌体形态和数量的变化。我们发现AD病人血浆来源的神经元外泌体中Totaltau,P-S396-tau和Aβ1-42水平均高于年龄匹配的正常人，除此之外，与...
【技术保护点】
1.一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于包括如下步骤：/nS1，血浆外泌体提取:从-80℃取出血浆放在4℃温度中溶化,然后取出250μl血浆于无菌离心管，离心去除细胞和细胞碎片,转移上清液于无菌离心管中，加入63μl外泌体沉淀剂进行混匀，放置于4℃温度里30min，然后离心至外泌体为圆饼状贴在管底，吸去上清液，然后将剩余的液体重新1500×g离心5min，吸去瓶里所有液体，不要碰到瓶底的外泌体；/nS2，酶联免疫吸附实验：在从血浆提取出来的外泌体中加入300μlRIPA蛋白裂解液和3μlcocktail蛋白抑制剂，然后涡旋使沉淀重悬于溶液中，将溶液置于-8...
【技术特征摘要】
1.一种利用血浆外泌体检测AD生物标志物的方法，其特征在于包括如下步骤：
S1，血浆外泌体提取:从-80℃取出血浆放在4℃温度中溶化,然后取出250μl血浆于无菌离心管，离心去除细胞和细胞碎片,转移上清液于无菌离心管中，加入63μl外泌体沉淀剂进行混匀，放置于4℃温度里30min，然后离心至外泌体为圆饼状贴在管底，吸去上清液，然后将剩余的液体重新1500×g离心5min，吸去瓶里所有液体，不要碰到瓶底的外泌体；
S2，酶联免疫吸附实验：在从血浆提取出来的外泌体中加入300μlRIPA蛋白裂解液和3μlcocktail蛋白抑制剂，然后涡旋使沉淀重悬于溶液中，将溶液置于-80℃的温度5min，25℃水浴锅5min，如此重复3个循环，将溶液存放于-80℃的温度中，在需要的时候拿出来在4℃下进行溶化，采用酶联生物的人β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)/人Tau蛋白(Tau)/人磷酸化tau(Ps396-tau)酶联吸附免疫实验试剂盒，分别检测Aβ1-42、Tau、Ps396-tau，严格按照说明书进行实验，从试剂盒中的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃冰箱，设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔中加入待测样本50μL，空白孔不加，除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃温育60min，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满试剂盒提供的洗涤缓冲液350μL，静置1min，甩去洗涤缓冲液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次，每孔加入50μL试剂盒中的底物A和B，37℃避光孵育15min，每孔加入试剂盒提供的终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
S3，拍摄电镜照片：将外泌体沉淀重悬于30μLPBS中，然后取出10μL并在90μLPBS中稀释，将3μL滴于电子显微镜中带有碳膜的铜网上，1分钟后，吸去多余的液体并滴入一滴磷钨酸染料溶液，1分钟后，再次吸走多余的液体，使样品风干，将完全干燥的铜网安装在Philips-FEITecnaiTlO的TEM下，然后拍照；
S4，NTA...
【专利技术属性】
技术研发人员：江海松，富磊，顾天生，
申请(专利权)人：上海惠皓医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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