用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸及制备方法技术

本发明专利技术提供了一种用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸及制备方法，该胶体金免疫层析试纸包括：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板；所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接粘贴在底板上；其中，金标垫上吸附有胶体金标记的鸭瘟病毒UL2蛋白、胶体金标记的鸭瘟病毒gI蛋白和胶体金标记的山羊抗兔IgG；硝酸纤维素膜上含有T1线、T2线和C线，T1线上含有鸭瘟病毒UL2蛋白，T2线上含有鸭瘟病毒gI蛋白，C线上含有兔IgG。本发明专利技术提供的胶体金免疫层析试纸可有效鉴别鸭瘟商业弱毒疫苗免疫和野毒感染鸭血清抗体，其灵敏度高、特异性好、重复性好、稳定性佳。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸及制备方法
本专利技术属于胶体金免疫层析试纸
，具体涉及一种用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸及制备方法。
技术介绍
胶体金免疫层析技术是1971年首次由Faulk和Taylor将胶体金与抗体结合检测沙门氏菌，由此引入免疫化学。Osikowicz等于1990年建立了第一个胶体金免疫层析实验。已经成为现在动物疫病检测中实用的检测技术之一。这是一种基于抗原-抗体特异性结合特征的新型免疫标记技术，使用胶体金作为抗原-抗体的示踪标记，可用于定性或半定量检测病原体获得血清抗体。该方法操作简便，不需要使用特殊的仪器，也不需要特殊培训就能够操作，肉眼可以观察结果，从而保证了临床便利性，使得该试纸条适合临床及大批量的检测。胶体金本身是一种颜色指示剂，不需要添加另外的显色试剂，即可在10分钟内用肉眼获得结果，其快速，简单，便宜且直观，适合现场测试，目前已经广泛用于病毒，细菌，寄生虫和药物残留的检测。免疫胶体金试纸条技术有很多种，目前应用较多的主要有斑点免疫金渗滤法(Dot-immunogoldfiltrationassay,DIGFA)和胶体金免疫层析法(colloidalfoldimmunochromatography,GICA)。鸭瘟又称鸭病毒性肠炎，是由鸭瘟病毒引起的急性，高温，传染性和致命性疾病。鸭瘟病毒(DPV)感染鸭和鹅及雁形目禽类。其特征是病鸭抑郁、厌食、发热、羽毛变色、疲倦、声音嘶哑、鼻塞、眼睑和头颈肿胀、流泪、腹泻，白绿色的粪便、恶臭、萎缩、充血、泄殖腔粘膜水肿，有绿色的伪膜覆盖物。严重感染的鸭子表现出呼吸困难、共济失调和瘫痪。1923年Baudet首次报道了该疾病。在中国，由黄引贤等报道1957年首次爆发。鸭瘟病毒流行广泛，其死亡率高达100％，减蛋率达50％，给鸭业造成巨大的经济损失。目前已经证实，DPV弱毒疫苗可以有效诱导体液和细胞介导的免疫反应并预防鸭瘟的感染。DPV商业弱毒疫苗广泛用于预防鸭瘟并取得了良好的效果。然而，仍然有报道鸭瘟商业弱毒疫苗免疫鸭感染鸭瘟的情况。因此，，仅依靠弱毒疫苗免疫很难对鸭瘟进行净化，弱毒疫苗免疫的同时筛除已感染鸭对于鸭瘟的净化具有重要的意义。由于目前缺乏能区分鸭瘟强毒感染与弱毒疫苗免疫鸭血清抗体的方法，使得拟通过免疫来净化DPV感染的方案缺乏技术支撑。目前，有许多常规方法可以用于诊断鸭瘟。包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、病毒分离与鉴定、聚合酶链反应(PCR)、血凝实验、中和实验和环介等温扩增等方法。这些方法各有其优缺点。据目前我们所了解，只有PCR用于区分鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染鸭。但是，PCR存在一些缺点使其不能使用于田间检测，如需要用到专用设备、操作复杂、花费时间较长费时、不适合快速大批量的临床检测及需要熟练的技术人员等。目前胶体金免疫层析技术用于鸭瘟血清抗体的检测已有报道，但是只能够单纯的检测鸭瘟血清抗体，不能够用于区别鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭和野毒感染鸭。因此研制能够快速，简便且适合用于田间诊断的胶体金免疫层析试纸条就显得十分重要。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种用于鉴别鸭瘟商业弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸及其制备方法，该试纸条可以快速、方便的区别鸭瘟商业弱毒免疫鸭和野毒感染鸭。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸，包括：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接粘贴在底板上，并确保接头处有叠压，使层析能顺利进行；其中，金标垫上吸附有胶体金标记的鸭瘟病毒UL2蛋白、胶体金标记的鸭瘟病毒gI蛋白和胶体金标记的山羊抗兔IgG；硝酸纤维素膜上含有T1线、T2线和C线，T1线上含有鸭瘟病毒UL2蛋白，T2线上含有鸭瘟病毒gI蛋白，C线上含有兔IgG。进一步地，鸭瘟病毒UL2蛋白在硝酸纤维素膜上的包被浓度为0.5-2.5mg/ml，优选1.5mg/ml。进一步地，鸭瘟病毒gI蛋白在硝酸纤维素膜上的包被浓度为0.5-2.5mg/ml，优选2.5mg/ml。进一步地，胶体金标记的鸭瘟病毒UL2蛋白的浓度为50-250ug/ml，优选200ug/ml；胶体金标记的鸭瘟病毒gI蛋白的浓度为50-250ug/ml，优选250ug/ml；胶体金标记的山羊抗兔IgG的浓度为20-40μg/ml，优选30μg/ml。进一步地，胶体金标记的鸭瘟病毒UL2蛋白通过以下方法制得：将胶体金溶液和碱性溶液混合，调节胶体金溶液pH值至蛋白质等电点，然后加入鸭瘟病毒UL2蛋白，混匀，制得；其中，碱性溶液优选浓度为0.1mol/l的K2CO3溶液。进一步地，胶体金标记的鸭瘟病毒gI蛋白通过以下方法制得：将胶体金溶液和碱性溶液混合，调节胶体金溶液pH值至蛋白质等电点，然后加入鸭瘟病毒gI蛋白，混匀，制得；其中，碱性溶液优选浓度为0.1mol/l的K2CO3溶液。进一步地，胶体金标记的山羊抗兔IgG通过以下方法制得：将胶体金溶液和碱性溶液混合，调节胶体金溶液pH值至蛋白质等电点，然后加入山羊抗兔IgG，混匀，制得；其中，碱性溶液优选浓度为0.1mol/l的K2CO3溶液。进一步地，金标垫通过以下方法制备得到：将玻璃纤维素膜浸于含50-250μg/ml的胶体金标记的鸭瘟病毒UL2蛋白、50-250μg/ml的胶体金标记的鸭瘟病毒gI蛋白和20-40μg/ml的胶体金标记的山羊抗兔IgG的混合溶液中，于37℃干燥过夜，制得。上述用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：(1)将鸭瘟病毒UL2蛋白、gI蛋白和山羊抗兔IgG分别划线于硝酸纤维素膜上，形成T1、T2线和C线，然后将硝酸纤维素膜置于37℃干燥2h；(2)将样品垫、金标垫、步骤(1)处理后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘连在底板上，硝酸纤维素膜上的T1线靠近金标垫，T2线靠近吸水纸，C线位于检测线T1和T2的中间，然后将其切割成试纸条，制得。采用上述试纸条鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的方法，包括：将血清样品经加样孔滴加在样品垫上，样品在层析纸条上前移，并与金标垫上的胶体金标记抗原反应并显色，根据显色结果判定血清样品来自鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭或野毒感染鸭；当T1、T2线和C线均显色时，结果为阳性，说明血清样品中含有抗UL2蛋白的抗体，说明该血清样品来自野毒感染鸭；当只有T2线和C线显色时，说明血清样品中不含有抗UL2蛋白抗体但是含有鸭瘟病毒的血清抗体，说明该血清样品来自鸭瘟商业弱毒疫苗免疫鸭；当只有C线显色时，结果为阴性，说明血清样品中不含有抗鸭瘟病毒的抗体，则样品来自健康鸭；若C线不显色，则试纸条失效。本专利技术提供的用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸及其制备方法，具有以下有益效果：弱毒疫苗株和野毒株的UL2基因大小分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，包括：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板；所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接粘贴在底板上；其中，金标垫上吸附有胶体金标记的鸭瘟病毒UL2蛋白、胶体金标记的鸭瘟病毒gI蛋白和胶体金标记的山羊抗兔IgG；硝酸纤维素膜上含有T1线、T2线和C线，T1线上含有鸭瘟病毒UL2蛋白，T2线上含有鸭瘟病毒gI蛋白，C线上含有兔IgG。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，包括：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板；所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接粘贴在底板上；其中，金标垫上吸附有胶体金标记的鸭瘟病毒UL2蛋白、胶体金标记的鸭瘟病毒gI蛋白和胶体金标记的山羊抗兔IgG；硝酸纤维素膜上含有T1线、T2线和C线，T1线上含有鸭瘟病毒UL2蛋白，T2线上含有鸭瘟病毒gI蛋白，C线上含有兔IgG。


2.根据权利要求1所述的用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，鸭瘟病毒UL2蛋白在硝酸纤维素膜上的包被浓度为0.5-2.5mg/ml。


3.根据权利要求1所述的用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，鸭瘟病毒gI蛋白在硝酸纤维素膜上的包被浓度为0.5-2.5mg/ml。


4.根据权利要求1所述的用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，胶体金标记的鸭瘟病毒UL2蛋白的浓度为50-250μg/ml；胶体金标记的鸭瘟病毒gI蛋白的浓度为50-250μg/ml；胶体金标记的山羊抗兔IgG的浓度为20-40μg/ml。


5.根据权利要求1或4所述的用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，胶体金标记的鸭瘟病毒UL2蛋白通过以下方法制得：将胶体金溶液和碱性溶液混合，调节胶体金溶液pH值至蛋白质等电点，然后加入鸭瘟病毒UL2蛋白，混匀，制得。


6.根据权利要求1或4所述的用于鉴别鸭瘟弱毒疫苗免疫和野毒感染的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，胶体金标记的鸭瘟病毒gI蛋白通过以下方法制得：将胶体金溶液和碱性溶液混合，调节胶体金溶液pH值至蛋白质等电点，然后加入鸭瘟病毒g...

【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，周晓凤，汪铭书，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51