内酰胺酶及其应用和酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种内酰胺酶及其应用和酶法拆分制备(1R，4S)‑文斯内酯的方法，该内酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。用于编码上述内酰胺酶的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。酶法拆分制备(1R，4S)‑文斯内酯的方法包括：在缓冲液体系中，将底物和上述内酰胺酶混合反应，底物为2‑氮杂双环[2.2.1]庚‑5‑烯‑3‑酮。该内酰胺酶具有底物耐受度高，活性高的特点，将其用于酶法拆分制备(1R，4S)‑文斯内酯中的方法中，其能够使得较高浓度的底物在该内酰胺酶的作用下充分反应，获得收率和手性纯度较高的(1R，4S)‑文斯内酯，提供了生产效率，降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
内酰胺酶及其应用和酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法
本专利技术涉及生物工程
，具体而言，涉及一种内酰胺酶及其应用和酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法。
技术介绍
γ-内酰胺是化合物2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的简称(亦俗称为文斯内酯)，其分子式为C6H7NO。γ-内酰胺的其中一个异构体为(-)-γ-内酰胺即(1R，4S)-文斯内酯，由光学纯的(1R，4S)-文斯内酯出发合成的药物主要有抗HIV药物阿巴卡韦，由(1S，4R)-文斯内酯出发合成的主要有抗流感药物帕拉米韦。因而拆分制备(1R，4S)-文斯内酯具有重要的经济价值和社会价值。目前，通常采用生物催化法来获得光学纯的(1R，4S)-文斯内酯，但是目前用于生物催化法的酶的耐受度及活性普遍不太高，导致可正常进行的反应体系的底物浓度较小，降低了生产效率，成本较高。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种内酰胺酶及其应用和酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法，以改善上述问题。本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术实施方式提供了一种内酰胺酶，该内酰胺酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。第二方面，本专利技术实施方式还提供了一种核酸分子，其用于编码上述内酰胺酶，可选地，该核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。第三方面，本专利技术实施方式还提供了上述内酰胺酶在酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯中的应用。第四方面，本专利技术实施方式还提供了一种酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法，其包括：在缓冲液体系中，将底物和上述内酰胺酶混合反应，底物为2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮。本专利技术的上述实施方式中的至少一种方案具有以下有益效果：本专利技术实施方式的内酰胺酶具有底物耐受度高，活性高的特点，将其用于酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯中的方法中，其能够使得较高浓度的底物在该内酰胺酶的作用下充分反应，获得收率和手性纯度较高的(1R，4S)-文斯内酯，提供了生产效率，降低了生产成本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施方式的酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法的流程图；图2为本专利技术实施例1的反应≥99％后的中间产物的高效液相色谱检测图；图3为本专利技术实施例1的反应≥99％后的目标产物的高效液相色谱检测图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术提供的一种内酰胺酶及其应用和酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法进行具体说明。本专利技术的一些实施方式提供了一种内酰胺酶，该内酰胺酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1为：专利技术人针对通过酶法拆分方法来获得(1R，4S)-文斯内酯，进而重新设计了一种内酰胺酶的氨基酸序列，该内酰胺酶具有较佳的立体选择性、反应条件温和、更好的环境友好性以及利于工业放大应用的特点。此外，该内酰胺酶的耐受度和活性较高，能够满足反应体系中较高底物浓度的反应需求，提高了生产效率，降低了生产成本。本专利技术的一些实施方式还提供了一种用于编码上述内酰胺酶的核酸分子，该核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2为：通过上述核酸分子可以通过现有基因工程的方法编码得到上述内酰胺酶。本专利技术的一些实施方式还提供了上述内酰胺酶在酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯中的应用。本专利技术的一些实施方式还提供了一种酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法，其包括：在缓冲液体系中，将底物和上述内酰胺酶混合反应，底物为2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮。其具体的合成路线为：具体地，一些实施方式中，底物和上述内酰胺酶混合反应的反应温度为15～40℃，例如，反应温度可以为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或45℃，优选地，反应温度为20～35℃，更优选地，反应温度为25～30℃。通过选择特定的反应温度有利于内酰胺酶和底物之间更好的相互作用，达到较佳的反应效果，提高收率和目标产物的纯度。为了满足内酰胺酶对底物充分作用，达到较佳的反应拆分的目的，需要对内酰胺酶的用量进行控制，因此，一些实施方式中，内酰胺酶的用量为底物质量的1％～2％，优选为1％。内酰胺酶的用量过少时，反应不充分，使得收率和产物纯度降低，而内酰胺酶用量过多时，容易造成浪费，增加生产成本。进一步地，为了达到对内酰胺酶的充分利用，同时也能够使得反应过程能够充分进行，一些实施方式中，底物在缓冲溶液体系中的浓度小于700g/L。底物浓度超过该范围后，容易导致其超过内酰胺酶的耐受能力，造成收率和产物纯度降低。进一步地，优选底物在缓冲溶液体系中的浓度为500～600g/L，更优选地，底物在缓冲溶液体系中的浓度为550～600g/L。该范围的底物浓度既使得反应过程中尽可能地使得底物浓度达到比较大的程度，同时也能够满足目标产物在收率和纯度上的要求。进一步地，本专利技术上述实施方式中的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲液，优选地，磷酸盐缓冲液的浓度为8～12mM，例如，磷酸盐缓冲液的浓度为10mM更优选地，在反应过程中，磷酸盐缓冲液保持pH为6～8，优选pH为7。磷酸盐缓冲溶液中含有磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，磷酸氢二钠在缓冲溶液中的质量浓度可为4.328g/L，磷酸二氢钾在缓冲溶液中的质量浓度可为2.65g/L。一些实施方式中，在反应后，加入有机溶剂进行萃取，优选地，有机溶剂为二氯甲烷。需要说明的是有机溶剂在其他实施方式中也可以选择乙醚等只要能够对目标产物能够进行萃取的溶剂，在此并不做限制。一些实施方式中，加入有机溶剂混合均匀后，先进行浓缩，再加入有机溶剂进行萃取。加入有机溶剂进行混合的方式为搅拌，搅拌时间可以为10分钟，也可以根据溶液体量进行调整。具体地，一些实施方式中，在反应≥99％后，加入反应体系3～5vt％的二氯甲烷，搅拌均匀后，浓缩至0.5～0.7的体积，例如浓缩至3/5的体积，再加入二氯甲烷萃取三次，然后去除溶剂。其中，加入萃取三次所用二氯甲烷的体积依次为浓缩液体积的0.9～1.1倍、0.9～1.1倍和0.4～0.6倍，例如，所用二氯甲烷的体积依次为浓缩液体积的1倍、1倍和0.5倍。需要说明的是，去除溶剂的方法可以为蒸发溶剂的方式进行。具体地，参见附图1的流程图，本专利技术的一些实施方式提供了一种酶法拆分制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内酰胺酶，其特征在于，所述内酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种内酰胺酶，其特征在于，所述内酰胺酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种核酸分子，其特征在于，其用于编码如权利要求1所述的内酰胺酶，优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.如权利要求1所述的内酰胺酶在酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯中的应用。


4.一种酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法，其特征在于，其包括：在缓冲液体系中，将底物和如权利要求1所述的内酰胺酶混合反应，所述底物为2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮。


5.根据权利要求4所述的酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法，其特征在于，所述反应温度为15～40℃，优选为20～35℃，更优选为25～30℃。


6.根据权利要求4所述的酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法，其特征在于，所述内酰胺酶的用量为所述底物质量的1％～2％，优选为1％。


7.根据权利要求4所述的酶法拆分制备(1R，4S)-文斯内酯的方法，其特征在于，所述底物在缓冲溶液体系中的浓度小于700g/L，优选地，所述底物在缓冲溶液体系中的浓度为500～600g/L，更优选地，所述底物在缓冲溶液体系中的浓度为550～600g/L。

<...

【专利技术属性】
技术研发人员：高仰哲，吴法浩，李钢，王志航，
申请(专利权)人：安徽红杉生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34