一种改良酶消化法分离骨细胞的技术及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种改良酶消化法分离骨细胞的技术及其应用，涉及骨细胞培养技术领域，具体而言，该分离培养方法通过酶解消化骨胶原和分步脱钙，能稳定分离并获得高纯度的骨细胞和成骨细胞，且分离的效率高，操作简单易实施，为骨细胞和/或成骨细胞的功能研究提供了一种新的途径。

【技术实现步骤摘要】
一种改良酶消化法分离骨细胞的技术及其应用
本专利技术涉及骨细胞培养
，具体而言，涉及一种改良酶消化法分离骨细胞的技术及其应用。
技术介绍
近年来，研究发现骨细胞具有调控骨代谢的功能，不但调节骨的生成，而且调节骨的吸收[SchafflerMB,CheungWY,MajeskaR,etal.Osteocytes:masterorchestratorsofbone.Calcifiedtissueinternational2014；94:5-24],因而其对骨稳态的维持具有重要意义。骨细胞是骨中最丰富的一类细胞，约占骨中所有细胞的95％以上。由于骨细胞被骨基质包埋，所以以前认为骨细胞是静止的、无功能的细胞[SchafflerMB,CheungWY,MajeskaR,etal.Osteocytes:masterorchestratorsofbone.Calcifiedtissueinternational2014；94:5-24]。但是，包埋在基质里的骨细胞借助其丰富的突触结构连接自身，形成纵横交错的特殊网络状结构[BonewaldLF.Theamazingosteocyte.Journalofboneandmineralresearch:theofficialjournaloftheAmericanSocietyforBoneandMineralResearch2011；26:229-38.]，使得其能敏感地感知局部和全身的信号刺激、处理信号，发生适应性应答。且骨细胞具有内分泌功能，能分泌一些化学分子和细胞因子[HeinoTJ,HentunenTA,VaananenHK.Osteocytesinhibitosteoclasticboneresorptionthroughtransforminggrowthfactor-beta:enhancementbyestrogen.JCellBiochem2002；85:185-97.Caballero-AliasAM,LoveridgeN,PitsillidesA,etal.OsteocyticexpressionofconstitutiveNOsynthaseisoformsinthefemoralneckcortex:acase-controlstudyofintracapsularhipfracture.Journalofboneandmineralresearch:theofficialjournaloftheAmericanSocietyforBoneandMineralResearch2005；20:268-73.ShengMH,LauKH,BaylinkDJ.RoleofOsteocyte-derivedInsulin-LikeGrowthFactorIinDevelopmentalGrowth,Modeling,Remodeling,andRegenerationoftheBone.Journalofbonemetabolism2014；21:41-54.]。它们还通过网络结构连接间充质干细胞、成骨细胞、软骨细胞以及血管内皮细胞等，调控成软骨、成骨及成血管等活动[BonewaldLF.Theamazingosteocyte.Journalofboneandmineralresearch:theofficialjournaloftheAmericanSocietyforBoneandMineralResearch2011；26:229-38.]。故此，对其作用的细胞和分子机制的研究正在迅速兴起[BellidoT.Osteocyte-drivenboneremodeling.Calcifiedtissueinternational2014；94:25-34.]。骨细胞特异分泌的硬骨素(Sclerostin)高亲和地结合低密度脂蛋白5(LRP-5)，抑制Wnt信号通路，从而抑制成骨细胞活性，并降低骨形成[BonewaldLF,JohnsonML.Osteocytes,mechanosensingandWntsignaling.Bone2008；42:606-15.]。临床上vanBuchem和Sclerosteosis病就因为硬骨素缺失或移码突变而提高骨量或骨形成[BalemansW,PatelN,EbelingM,etal.Identificationofa52kbdeletiondownstreamoftheSOSTgeneinpatientswithvanBuchemdisease.Journalofmedicalgenetics2002；39:91-7.LootsGG,KneisselM,KellerH,etal.Genomicdeletionofalong-rangeboneenhancermisregulatessclerostininVanBuchemdisease.Genomeresearch2005；15:928-35.BrunkowME,GardnerJC,VanNessJ,etal.BonedysplasiasclerosteosisresultsfromlossoftheSOSTgeneproduct,anovelcystineknot-containingprotein.Americanjournalofhumangenetics2001；68:577-89.TerhiJTAH,andH.KalervoOsteocytesinhibitosteoclasticboneresorptionthrougthtransforminggrowthfactor-βenhancementbyestrogen.Journalofcellularbiochemistry2002；85:12.]。美国Amgen公司生产硬骨素中和抗体，增加骨量和骨强度[PasztyC,TurnerCH,RobinsonMK.Sclerostin:agemfromthegenomeleadstobone-buildingantibodies.Journalofboneandmineralresearch:theofficialjournaloftheAmericanSocietyforBoneandMineralResearch2010；25:1897-904.]，且该抗体已进入临床三期试验。此外，骨细胞可以直接调控骨吸收，Xiong[XiongJ,OnalM,JilkaRL,etal.Matrix-embeddedcellscontrolosteoclastformation.Naturemedicine2011；17:1235-41.]和Nakashima[NakashimaT,HayashiM,FukunagaT,etal.EvidenceforosteocyteregulationofbonehomeostasisthroughRANKLexpression.Naturemedicine2011；17:1231-4.]几乎同时发现体内骨细胞通过表达RankL调节破骨细胞形成，从而调控体内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种骨细胞的分离培养方法，其特征在于，其包括以下步骤：胶原酶溶液对骨组织碎片的消化时长达60～80min后，收集消化后的第一上清液和第一骨组织碎片；/n将EDTA溶液和胶原酶溶液以交替处理的方式处理所述第一骨组织碎片，交替处理中，胶原酶溶液消化第一骨组织碎片的时长达20～30min后，EDTA溶液消化第一骨组织碎片的时长达15～25min；消化后，获取剩余的第二骨组织碎片；/n将EDTA溶液和胶原酶溶液以交替处理的方式处理所述第二骨组织碎片，交替处理中，胶原酶溶液消化第二骨组织碎片的时长达40～60min后，EDTA溶液消化第二骨组织碎片的时长达5～15min；消化后，获取剩余的第三骨组织碎片，并合并交替处理获取的上清作为第三上清液。/n

【技术特征摘要】
1.一种骨细胞的分离培养方法，其特征在于，其包括以下步骤：胶原酶溶液对骨组织碎片的消化时长达60～80min后，收集消化后的第一上清液和第一骨组织碎片；
将EDTA溶液和胶原酶溶液以交替处理的方式处理所述第一骨组织碎片，交替处理中，胶原酶溶液消化第一骨组织碎片的时长达20～30min后，EDTA溶液消化第一骨组织碎片的时长达15～25min；消化后，获取剩余的第二骨组织碎片；
将EDTA溶液和胶原酶溶液以交替处理的方式处理所述第二骨组织碎片，交替处理中，胶原酶溶液消化第二骨组织碎片的时长达40～60min后，EDTA溶液消化第二骨组织碎片的时长达5～15min；消化后，获取剩余的第三骨组织碎片，并合并交替处理获取的上清作为第三上清液。


2.根据权利要求1所述的骨细胞的分离培养方法，其特征在于，交替处理中，所述胶原酶溶液每次对第一骨组织碎片和/或第二骨组织碎片的处理时间为20～30min；
优选地，交替处理中，EDTA溶液每次对第一骨组织碎片和/或第二骨组织碎片的消化条件为：温度36-38℃，时间8～12min；
优选地，第一骨组织碎片的交替处理方式具体为：依次采用EDTA溶液、胶原酶溶液和EDTA溶液的顺序进行交替处理；
第二骨组织碎片的交替处理方式具体为：依次采用胶原酶溶液、EDTA溶液和胶原酶溶液的顺序进行交替处理。


3.根据权利要求1或2所述的骨细胞的分离培养方法，其特征在于，胶原酶溶液对所述骨组织碎片消化的方式为分批次消化，每次消化的条件为：温度36～38℃，时间20～30min；
优选地，所述胶原酶溶液为I型胶原酶溶液；
优选地，所述I型胶原酶溶液的工作浓度为0.05～0.5％。...

【专利技术属性】
技术研发人员：涂小林，曾继涛，王波，刘光亮，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50