一种制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法及其固定方法和应用技术

本发明专利技术涉及生命科学及医疗技术领域，尤其涉及培养规则形状的诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法及其固定方法及应用。本发明专利技术所提供的制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，具体步骤包括缩印制备步骤和多能干细胞制备步骤。本发明专利技术的有益效果是，结合生物工程中的缩印技术以及生物化学技术，培养和人体心肌细胞相似的、成熟的、规则形状的诱导多能干细胞源性心肌细胞，并且制造成本低、产量高，培养时间短。本发明专利技术能保持所需要的细胞形态，移植到所需的环境中进行深入实验和研究。

【技术实现步骤摘要】
一种制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法及其固定方法和应用
本专利技术涉及生命科学及医疗
，尤其涉及利用生物工程的缩印技术（micropatterning）制备诱导长杆型多能干细胞源性心肌细胞的方法及其固定方法。
技术介绍
多能干细胞是近年来由日本科学家山中伸弥（ShinyaYamanaka）教授于2006年研发出，是目前最接近人体本身的实验模型。多能干细胞具有和细胞源头一样的基因库，在正确的实验环境下可以最大限度的体现遗传疾病或基因缺陷表型。多能干细胞通过诱导培育手法可以分化出单层人源心肌细胞，进而研究病理或对有表型的遗传性心肌病进行药筛。目前市面上所培育的诱导多能干细胞源性心肌细胞大致分为两种，一种为平面（2Dculture）培养细胞，另一种为三维类器官培养（3Dculture）。其中，成熟多能干细胞源性心肌细胞为最接近人体的长杆型的心肌细胞形态。现有技术中所培养的诱导多能干细胞源性心肌细胞（inducedPluripotentStemCellderivedCardiomyocytes），缺乏有效培养规则形状的成熟多能干细胞源性心肌细胞的方法。目前已知的手法所培养出的多能干细胞源性心肌细胞多为单层，形状不规则的多能干细胞源性心肌细胞。即使有极少数实验室及单位能够将二维细胞以三维的培养手法形成规则的成熟多能干细胞源性心肌细胞，但是其制造成本高，产量低，且所需时间远高于直接培养二维多能干细胞源性心肌细胞。专利技术人发现，即使能培育出成熟的多能干细胞源性心肌细胞，也存在难以在保持多能干细胞源性心肌细胞形态的前提下，将所培养的多能干细胞源性心肌细胞移植到各个不同的平台进行不同的实验。同时，在无法以长杆型多能干细胞源性心肌细胞为模型在不同的实验环境中进行实验的情况下，我们无法有效的在实验中获取最接近人类心脏生理功能的数据。由此可以看出，在现有的培养诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法中，无论是二维培养的诱导多能干细胞源性心肌细胞，还是三维培养的诱导多能干细胞源性心肌细胞，都存在的难以解决的问题是，无法将细胞培养至成熟，达到与人体心肌细胞相似的规则形态，并且制造成本高，产量低，且所需时间长。
技术实现思路
为解决现有技术的缺陷和不足，本专利技术的目的是提供一种诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，以及其固定方法及应用。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，包括缩印制备步骤和多能干细胞制备步骤，其中：（1）所述的缩印制备步骤，包括S01.将所需要的细胞形态以镭射刻在硅片上;S02.在所述硅片表面覆盖一层PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液,放置于65摄氏度的恒温箱过夜或至完全凝固，取下凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷;S03.在所述取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆盖细胞培养基质胶;以及S04.以覆盖了细胞培养基质胶的PDMS或聚二甲基硅氧烷为模板，在细胞培养盘表面刻印长方形；（2)所述的多能干细胞制备步骤，包括S1.提取养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞；S2.将养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞种植于所述表面刻印长方形的细胞培养盘中；S3.培养三至五日，至诱导多能干细胞源性心肌细胞成长为所需要的形态并恢复跳动，由此得到诱导多能干细胞源性心肌细胞。进一步地，所述的所需要的细胞形态为长杆型。进一步地，所述的PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液为1:5至1:20的PDMS原液兑凝固液；优选的，所述的PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液优选为1:10的PDMS原液兑凝固液。进一步地，所述的细胞培养基质胶由基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成的。进一步地，所述的基质胶为Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质，层粘连蛋白，明胶或纤连蛋白；优选的，所述的基质胶为Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质。进一步地，所述的含氨基酸及葡萄糖的培养基优选为DMEM培养基。更进一步地，所述的基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~400；优选的，所述的基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~100；更优选的，所述的基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:1~10。最优选的，所述基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成比浓度为1:10。进一步地，在所述细胞培养盘表面刻印1.0乘以7.0微米的长方形。更进一步地，上述的制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，还包括固定步骤和提取步骤，其中，所述固定步骤包括将上述方法所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞，在含有BDM或2,3-丁二酮单肟的试剂中，常温浸泡三至五分钟；所述的提取步骤包括使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化诱导多能干细胞源性心肌细胞所粘黏的细胞培养基质胶后，提取诱导多能干细胞源性心肌细胞。本专利技术还提供了一种涨缩细胞的固定方法，将所述涨缩细胞在含有BDM或2,3-丁二酮单肟的试剂中，常温浸泡三至五分钟；优选的，所述涨缩细胞为心肌细胞或骨肌细胞。进一步地，所述涨缩细胞为上述任一项制备方法所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞。进一步地，所述的BDM或2,3-丁二酮单肟为含有5.0%以下的BDM或2,3-丁二酮单肟试剂；优选的，所述的BDM或2,3-丁二酮单肟优选为含有0.1%的BDM或2,3-丁二酮单肟试剂。更进一步地，所述的固定方法还包括提取步骤，所述的提取步骤包括使用1:9的稳定型胰蛋白酶替代酶或10XTrypLE和干细胞级细胞消化液或Accutase混合液消化所固定的细胞表面粘黏的细胞培养基质胶后，提取所述固定的细胞。此外，本专利技术还提供了上述任一项制备方法或上述任一项固定方法的应用，用于将所述诱导多能干细胞源性心肌细胞移植到不同的环境进行培养，包括并不限于继续进行单细胞或多细胞培养和实验。本专利技术的有益效果是，结合生物工程中的缩印技术以及生物化学技术，成功培养出和人体心肌细胞相似的、成熟的、规则形状的诱导多能干细胞源性心肌细胞，并且制造成本低、产量高，培养时间短。本专利技术所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞，成熟率高，具规则的长杆形状，拥有清晰且有规律的线条型肌小节分布。使用本专利技术所培育出的成熟或长杆型多能干细胞源性心肌细胞，能有效减少在实验中所需的细胞数量，并且能够成功获取成熟单细胞的相关数据。本专利技术提供的技术方案能够成功固定所制备的诱导多能干细胞源性心肌细胞，并在保持所需要的细胞形态的情况下成功转移至不同的培养皿中，进行新的实验或在新的环境中培养。为研究结构性蛋白突变所导致的疾病提供实验模型，有效的在实验中获取最接近人类心脏生理功能的数据。综上所述，本专利技术不仅仅解决了无法将多能干细胞源性心肌细胞细胞培养至成熟的规则形状，达到与人体心肌细胞相似的形态，并且制造成本高、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，其特征在于，包括缩印制备步骤和多能干细胞制备步骤，其中：/n所述的缩印制备步骤，包括/nS01.将所需要的细胞形态以镭射刻在硅片上;/nS02.在所述硅片表面覆盖一层PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液,放置于65摄氏度的恒温箱过夜或至完全凝固，取下凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷;/nS03. 在所述取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆盖细胞培养基质胶;以及/nS04.以覆盖了细胞培养基质胶的PDMS或聚二甲基硅氧烷为模板，在细胞培养盘表面刻印长方形；/n（2)所述的多能干细胞制备步骤，包括/nS1.提取养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞；/nS2.将养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞种植于所述表面刻印长方形的细胞培养盘中；/nS3.培养三至五日，至诱导多能干细胞源性心肌细胞成长为所需要的形态并恢复跳动，/n由此得到诱导多能干细胞源性心肌细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备诱导多能干细胞源性心肌细胞的方法，其特征在于，包括缩印制备步骤和多能干细胞制备步骤，其中：
所述的缩印制备步骤，包括
S01.将所需要的细胞形态以镭射刻在硅片上;
S02.在所述硅片表面覆盖一层PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液,放置于65摄氏度的恒温箱过夜或至完全凝固，取下凝固的PDMS或聚二甲基硅氧烷;
S03.在所述取下的PDMS或聚二甲基硅氧烷表面覆盖细胞培养基质胶;以及
S04.以覆盖了细胞培养基质胶的PDMS或聚二甲基硅氧烷为模板，在细胞培养盘表面刻印长方形；
（2)所述的多能干细胞制备步骤，包括
S1.提取养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞；
S2.将养成初期的诱导多能干细胞源性心肌细胞种植于所述表面刻印长方形的细胞培养盘中；
S3.培养三至五日，至诱导多能干细胞源性心肌细胞成长为所需要的形态并恢复跳动，
由此得到诱导多能干细胞源性心肌细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的所需要的细胞形态为长杆型。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液为1:5至1:20的PDMS原液兑凝固液；
优选的，所述的PDMS或聚二甲基硅氧烷和凝固剂的混合液优选为1:10的PDMS原液兑凝固液。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养基质胶由基质胶和含氨基酸及葡萄糖的培养基组成的。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的基质胶为Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质，层粘连蛋白，明胶或纤连蛋白；
优选的，所述的基质胶为Matrigel或小鼠内瘤基底膜基质。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张家浩，曾雪，
申请(专利权)人：上海慧灯医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31