负载CpG ODN免疫佐剂的聚多巴胺纳米颗粒制备方法技术

本发明专利技术公开一种负载CpG ODN免疫佐剂的聚多巴胺纳米颗粒制备方法，利用多巴胺盐酸盐为原料，通过调整多巴胺盐酸盐浓度比例及反应时间与溶液PH，以及优选CpG ODN溶液浓度充分控制颗粒粒径的大小以及载药率，之后在表面修饰叶酸作为靶向功能团，最终制备出粒径在100～150纳米的颗粒，载药率为30％，并测试该纳米粒子的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
负载CpGODN免疫佐剂的聚多巴胺纳米颗粒制备方法
本专利技术涉及纳米医药
，更具体的是涉及一种负载CpGODN免疫佐剂的聚多巴胺纳米颗粒制备方法，并且在表面修饰叶酸作为靶向功能团。
技术介绍
目前为止肿瘤免疫治疗已成为最强大的技术治疗癌症；然而，免疫逃避以及肿瘤组织微环境刺激免疫反应信号的缺乏极大的限制了免疫治疗的效率。近年来，基于纳米颗粒光热免疫联合疗法显示出强大的功效，借助纳米平台建立一种快速、精准的联合治疗系统，将光热治疗和免疫治疗联合，不仅可以有效地控制肿瘤发展，而且大大增强了其抗癌效率。聚多巴胺颗粒具有较好的近红外吸收能力，较强的光热转化效率，较好的生物安全性和生物安全性，表面超强附着的特性，这些特性使聚多巴胺成为光热治疗和免疫治疗联合治疗纳米平台。CpGODN是具有未甲基化的胞嘧啶磷酸鸟嘌呤基序的寡脱氧核苷酸，是非常流行且廉价的免疫佐剂。它们被Toll样受体9(TLR9)识别，在鼠和人浆细胞样树突状细胞(DC)中广泛表达，并启动先天性和适应性反应的信号级联反应。利用聚多巴胺颗粒负载免疫佐剂CpGODN，并修饰叶酸靶向。通过尾静脉注射到荷瘤小鼠中，由于EPR效应及叶酸的靶向作用，纳米颗粒滞留在肿瘤组织中，用808激光照射肿瘤部位，聚多巴胺的光热效应诱导癌细胞产生免疫原性的细胞死亡，肿瘤细胞中钙网蛋白和磷脂酰丝氨酸酸外翻到细胞表面，暴露“eatme”信号，与此同时CpGODN在肿瘤部位缓解免疫抑制，有利于DC细胞向肿瘤部位的迁徙及成熟，之后CpGODN可以持续刺激促炎细胞因子的分泌和树突细胞的成熟，从而产生在肿瘤部位T淋巴细胞的活化和浸润。促进CTL诱导肿瘤凋亡，与此同时记忆T细胞的生成，可以抑制肿瘤的转移和长期复发。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提出了一种具有粒径小，细胞毒性小，具有靶向作用的聚多巴胺颗粒的制备方法。本专利技术的技术方案：一种负载CpGODN免疫佐剂的聚多巴胺纳米颗粒制备方法，利用多巴胺盐酸盐为原料，通过调整多巴胺盐酸盐浓度比例及反应时间与溶液PH，以及优选CpGODN溶液浓度充分控制颗粒粒径的大小以及载药率，之后在表面修饰叶酸作为靶向功能团，最终制备出粒径在100～150纳米的颗粒，载药率为30％，并测试该纳米粒子的稳定性。具体如下：1)将多巴胺盐酸盐溶于双蒸水中，制备成为浓度为0.5～5.0mg/mL多巴胺水溶液，超声5min使其分布均匀2)调节溶液的PH值为8～11，30～50℃条件下搅拌反应2～5h；3)待反应结束,用15000rpm，15min离心，除去多余的多巴胺，得到黑色的聚多巴胺纳米颗粒；4)2.0mg/mL的聚多巴胺水溶液与100～1000μg/mL浓度的CpGODN溶液搅拌孵育1～3h，离心去除多余的CpGODN，得到负载CpGODN免疫佐剂聚多巴胺纳米颗粒。5)将负载CpGODN免疫佐剂的聚多巴胺纳米颗粒重悬于含有叶酸的Tris缓冲液(10μmM，pH8.5)中。在室温下持续搅拌下孵育1h后，将功能化的纳米颗粒离心并用双蒸馏水洗涤3次。评估本专利技术制备的负载CpGODN免疫佐剂的聚多巴胺纳米颗粒的载药效果的方法如下：将制备好的聚多巴胺水溶液与的CpGODN溶液混合在一定反应体系，搅拌孵育1～3h，15000rpm，15min离心。尽可能多的收集离心上清液，通过nanodrop2000测定上清液中CpGODN的浓度，并根据反应体系的体积计算上清液中剩余的CpGODN的质量，载药率的公式计算如下：多巴胺是大脑中含量最丰富的儿茶酚胺类神经递质。在水溶液中,多巴胺的邻苯二酚基团很容易被氧化,生成具有邻苯二醌结构的多巴胺醌化合物。多巴胺和多巴胺醌之间发生反歧化反应,产生半醌自由基,然后偶合形成交联键，形成聚多巴胺颗粒。聚多巴胺颗粒具有较好的近红外吸收能力，较强的光热转化效率，较好的生物安全性和生物安全性，表面超强附着的特性，这些特性使聚多巴胺成为光热治疗和免疫治疗联合治疗纳米平台。CpGODN是具有未甲基化的胞嘧啶磷酸鸟嘌呤基序的寡脱氧核苷酸，是非常流行且廉价的免疫佐剂。它们被Toll样受体9(TLR9)识别，在鼠和人浆细胞样树突状细胞(DC)中广泛表达，并启动先天性和适应性反应的信号级联反应。CpGODN还可以直接缓解免疫抑制环境，改善抗肿瘤反应。另外CpGODN靶向的Toll样受体9(TLR9)，可以持续刺激促炎细胞因子的分泌和树突细胞的成熟，从而产生在肿瘤部位T淋巴细胞的活化和浸润。聚多巴胺颗粒负载免疫佐剂CpGODN，并修饰叶酸靶向。通过尾静脉注射到荷瘤小鼠中，由于EPR效应及叶酸的靶向作用，纳米颗粒滞留在肿瘤组织中，用808激光照射肿瘤部位，聚多巴胺的光热效应诱导癌细胞产生免疫原性的细胞死亡，肿瘤细胞中钙网蛋白和磷脂酰丝氨酸酸外翻到细胞表面，暴露“eatme”信号，与此同时CpGODN在肿瘤部位缓解免疫抑制，有利于DC细胞向肿瘤部位的迁徙及成熟，之后CpGODN可以持续刺激促炎细胞因子的分泌和树突细胞的成熟，从而产生在肿瘤部位T淋巴细胞的活化和浸润。促进CTL诱导肿瘤凋亡，与此同时记忆T细胞的生成，可以抑制肿瘤的转移和长期复发。聚多巴胺纳米颗粒作为一种绿色可降解的安全性较好纳米颗粒，可用于负载免疫佐剂CpGODN。将聚多巴胺水溶液与CpGODN溶液搅拌孵育一定时间，之后在表面修饰叶酸作为靶向功能团。这种方法可以大量连续生产载药的聚多巴胺纳米颗粒。制备完成的聚多巴胺纳米颗粒具备可生物降解、制备容易且可重复性好等特点。本专利技术的优势：1)合成过程简便，快捷，无毒无污染。2)实现较高的载药率。3)具有较低的细胞毒性。4)有较好的靶向作用。本专利技术制备的负载CpGODN免疫佐剂聚多巴胺纳米颗粒纳米颗粒，直径为100～150纳米，载药率为30％左右，并且在水溶液中具有较好的稳定性。本专利技术制备的负载CpGODN免疫佐剂聚多巴胺纳米颗粒，具有较好的生物安全性，细胞存活率为80％～95％。本专利技术制备的负载CpGODN免疫佐剂聚多巴胺纳米颗粒，具有较好的光热转化效率，在近红外激光的照射下，可以有效杀死肿瘤细胞，细胞存活率为50％～60％。附图说明图1：制备的负载CpGODN免疫佐剂聚多巴胺纳米颗粒纳米颗粒的扫描电子显微镜照片(形貌分析)图2：负载CpGODN免疫佐剂聚多巴胺纳米颗粒体外药物粒径图。图3：负载CpGODN免疫佐剂聚多巴胺纳米颗粒体外稳定性测试图。图4：制备成功的负载CpGODN免疫佐剂聚多巴胺纳米颗粒实物图。图5：负载CpGODN免疫佐剂聚多巴胺纳米颗粒细胞毒性分析柱状图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术不限于此。实施例11)将多巴胺盐酸盐溶于双蒸水中，制备成为浓度为1.0mg/mL多巴胺水溶液，超声5min使其分布均匀2)调节溶液的PH值为8，30℃条件下搅拌反应5h；<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.负载CpG ODN免疫佐剂的聚多巴胺纳米颗粒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)利用多巴胺盐酸盐为原料，调整多巴胺盐酸盐浓度比例及反应时间与溶液PH，以及优选CpG ODN溶液浓度控制颗粒粒径的大小以及载药率；/n2)在表面修饰叶酸作为靶向功能团，最终制备出粒径在100～150纳米的颗粒。/n

【技术特征摘要】
1.负载CpGODN免疫佐剂的聚多巴胺纳米颗粒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)利用多巴胺盐酸盐为原料，调整多巴胺盐酸盐浓度比例及反应时间与溶液PH，以及优选CpGODN溶液浓度控制颗粒粒径的大小以及载药率；
2)在表面修饰叶酸作为靶向功能团，最终制备出粒径在100～150纳米的颗粒。


2.根据权利要求1所述的负载CpGODN免疫佐剂的聚多巴胺纳米颗粒制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)将多巴胺盐酸盐溶于双蒸水中，制备成为浓度为0.5～5.0mg/mL多巴胺水溶液，超声使其分布均匀；
2)调节溶液的PH值为8～11，30～50℃条件下搅拌反应2～5h；
3)待反应结束，离心，除去多余的多巴胺，得到黑色的聚多巴胺纳米颗粒；
4)聚多巴胺水溶液与100～1000μg/mL浓度的CpGODN溶液搅拌孵育1～3h，离心去除多余的CpGODN，得到负载Cp...

【专利技术属性】
技术研发人员：常津，段玥，武晓丽，杨涵，高俊潇，魏道河，张越，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12