一种茄果类蔬菜中六种链格孢霉毒素的残留分析方法技术

本发明专利技术公开了一种茄果类蔬菜中六种链格孢霉毒素的残留分析方法，该方法包括如下步骤：(1)样品前处理；(2)采用超高效液相色谱串联质谱分析。本发明专利技术的茄果类蔬菜中六种链格孢霉毒素的残留分析方法，解决了分析物在碱性基质中产生结合残留而无法有效提取的问题，通过详细的前处理优化，超高效液相色谱串联质谱分析，能够准确的检测到茄果类蔬菜及其制品中六种链格孢霉毒素的残留量。

【技术实现步骤摘要】
一种茄果类蔬菜中六种链格孢霉毒素的残留分析方法
本专利技术涉及植物检测领域，具体的说涉及一种茄果类蔬菜中六种链格孢霉毒素的残留分析方法。
技术介绍
链格孢霉毒素是一类由链格孢霉菌分泌的代谢物，具有引起细胞DNA突变，提高癌症发病率等作用，是对人体存在较大危害的一类毒素。常见的链格孢霉菌代谢物主要指交链孢酚(alternariol，AOH)、交链孢酚单甲醚(alternariolmonomethylether，AME)、交链孢烯(altenuene，ALT)、细交链格孢酮酸(tenuazonicacid，TeA)、腾毒素(tentoxin,TEN)和细格菌素(altenusin，ALS)六种毒素。目前关于链格孢霉毒素的残留分析方法，主要集中在水果中几种毒素的污染水平分析，例如柑橘和枸杞中五种毒素的残留分析(AOH、AME、TeA、ALT、TEN)、水果中4种毒素(AOH、AME、TeA、ALT)的残留分析、葡萄中六种链格孢霉毒素(AOH、AME、TeA、ALT、TEN和ALS)(Toxins2019,11,87)，而且这些方法都是采用常规的外标法。2019年，陆续报道了采用同位素内标方法测定酒、蔬菜汁和水果汁中链格孢霉毒素及其螯合状态的链格孢霉毒素。在蔬菜种植中，链格孢霉菌严重影响蔬菜种植，能够引起早疫病、黑斑病类病害，在茄果类蔬菜中尤其突出，但是水果中的链格孢霉毒素残留分析方法对茄果类蔬菜中的效果不好，如ALS和茄子样本存在明显的结合，无法实现有效提取而导致检测不准确。目前针对茄果类蔬菜中链格孢霉菌毒素的残留分析尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种茄果类蔬菜中六种链格孢霉毒素的残留分析方法，该方法包括如下步骤：(1)样品前处理：称取样本，加入0.1-1mol/L盐酸水溶液，样本与盐酸水溶液的比例为1：0.1～10(克/mL)，于25～80℃水浴加热，时间为15～60min，再加乙腈，样本与乙腈的比例为1：2～5(克/mL)，涡旋提取5-20min，加氯化钠，样本与氯化钠的质量比为1：0.1～10，再次涡旋20～40s，4500r/min离心，取上清液；将固相萃取小柱用乙腈预淋洗，然后将上清液上样，再用乙腈洗脱小柱，收集淋洗液；在60℃水浴下氮吹近干，用乙腈溶解残渣，过0.22μmPTFE滤膜，待测；(2)采用超高效液相色谱串联质谱分析：超高效液相色谱串联质谱；色谱柱：WATERSACQUITYUPLCBEHC18(2.1×50mm，1.7μm)；流速：0.40mL/min；色谱柱柱温：40℃；进样量：5μL；流动相(A)甲醇，(B)0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～0.5min(10％A)；0.5～1.5min(10％A～90％A)；1.5～3.0min(90％A)；3.0～3.5min(90％A～10％A)；3.5～5.0min(10％A)。质谱条件：电喷雾离子源(ESI+)；多反应检测(MRM)模式；InterfaceVoltage：3.5KV；DL温度：250℃；HeatBlock温度：400℃；NebulizingGas流速：3.0L/min(N2,纯度99.999％)；干燥气流速：15L/min(N2，纯度99.999％)；其中六种链格孢霉毒素质谱条件见表1：表1六种链格孢霉毒素的质谱条件其中，步骤(1)中水浴温度优选为80℃，水浴加热时间优选为30min；优选的固相萃取小柱为C8固相萃取小柱；优选的样本与乙腈的比例为1：4克/mL；进一步优选的样品前处理步骤为：称取样本，加入0.5mol/L盐酸水溶液于80℃水浴(样本与盐酸水溶液的比例为1：1克/mL，即1克：1mL)，加热时间30min，再加乙腈(样本与乙腈的比例为1：4克/mL，即1克：4mL)，涡旋提取10min，加氯化钠(样本与氯化钠的质量比为1：1)，再次涡旋30s，4500r/min离心5min，取上清液，待净化；将C8固相萃取小柱先用乙腈预淋洗，然后将上清液上样，再用乙腈洗脱小柱，收集淋洗液；在60℃水浴下氮吹近干，用乙腈溶解残渣，过0.22μmPTFE滤膜，待测。本专利技术提供的茄果类蔬菜及其制品中六种链格孢霉毒素的残留分析方法，通过加酸加热的方式，解决了分析物在碱性基质中产生结合残留而无法有效提取的问题，通过详细的前处理优化，首次建立和验证了茄果类蔬菜及其制品中六种链格孢霉毒素的液相色谱串联质谱监测方法。所建方法，在线性浓度范围内，六种链格孢霉毒素的浓度和仪器响应呈良好线性关系，相关系数为R2大于0.998，其中ALT、ALS、AME、AOH、TeA和TEN的最小检出限分别为0.5μg/L、0.5μg/L、2μg/L、0.5～2μg/L、0.05～0.2μg/L、0.05～2μg/L和0.05μg/L。在三个添加水平下，五次重复下，茄果类蔬菜及其制品中，六种链格孢霉毒素的回收率在72％～107％，相对标准偏差均小于15％。按照最小添加水平为方法最小定量限，ALS、ALT、AOH、TeA和TEN的最小定量限均为2μg/kg，AME的最小定量限为5μg/kg，表明该方法均符合残留分析要求。附图说明图1不同酸度对茄子样本中六种链格孢霉毒素提取效率影响(n＝3)图2不同温度对六种链格孢霉毒素提取效率的影响(n＝3)图3不同提取乙腈体积对六种链格孢霉毒素提取效率的影响(n＝3)图4不同固相萃取小柱对六种链格孢霉毒素的回收率具体实施方式试剂与仪器来源：1、六种链格孢霉毒素标准品：AOH(CAS：641-38-3；95％)、AME(CAS：26894-49-5；99.5％)、ALT(CAS：889101-41-1；98％)、TeA(CAS：610-88-8；99.5％)、TEN(CAS：28540-82-1；99.39％)和ALS(CAS：31186-12-6；99.4％)均购自青岛科源生物科技有限公司；使用时，分别称取适量标准物质，用甲醇溶解，配置成1000mg/L标准溶液储备液，0～4℃保存。2、乙腈(色谱纯；美国Merck公司)、甲醇(色谱纯；美国Merck公司)；甲酸和乙酸铵(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；0.22μmPTFE滤膜(上海安谱实验科技股份有限公司)；氯化钠(分析纯，上海化学试剂公司)。3、固相萃取小柱C8(100mg,1mL)、C2(100mg，1mL)、PH(100mg,1mL)、PSA(100mg,1mL)GCE(100mg,1mL)、Al2O3(100mg,1mL)均购置于岛津(上海)实验器材有限公司；固相萃取小柱NH2(500mg,6mL)、Florisil(500mg,3mL)均购置于美国Agilent公司；固相萃取小柱C18(200mg,3mL)、HLB(60mg,3mL)、硅胶(1g,6mL)均购置于上海安谱实验科技股份有限公司。4、超高效液相色谱串联质谱(LC-MS8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种茄果类蔬菜中六种链格孢霉毒素的残留分析方法，其特征在于该方法包括如下步骤：/n(1)样品前处理：/n称取样本，加入0.1-1mol/L盐酸水溶液，样本与盐酸水溶液的比例为1：0.1～10克/毫升，于25～80℃水浴加热，时间为15～60min，再加乙腈，样本与乙腈的比例为1：2～5克/毫升，涡旋提取5～20min，加氯化钠，样本与氯化钠的质量比为1：0.1～10，再次涡旋20～40s，4500r/min离心，取上清液；将C

【技术特征摘要】
1.一种茄果类蔬菜中六种链格孢霉毒素的残留分析方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)样品前处理：
称取样本，加入0.1-1mol/L盐酸水溶液，样本与盐酸水溶液的比例为1：0.1～10克/毫升，于25～80℃水浴加热，时间为15～60min，再加乙腈，样本与乙腈的比例为1：2～5克/毫升，涡旋提取5～20min，加氯化钠，样本与氯化钠的质量比为1：0.1～10，再次涡旋20～40s，4500r/min离心，取上清液；将C8固相萃取小柱用乙腈预淋洗，然后将上清液上样，再用乙腈洗脱小柱，收集淋洗液；在60℃水浴下氮吹近干，用乙腈溶解残渣，过0.22μmPTFE滤膜，待测；
(2)采用超高效液相色谱串联质谱分析：
超高效液相色谱串联质谱；色谱柱：WATERSACQUITYUPLCBEHC18，2.1×50mm，1.7μm；流速：0.40mL/min；色谱柱柱温：40℃；进样量：5μL；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％甲酸水溶液；
梯度洗脱程序：0～0.5min，10％A；0.5～1.5min，10％A～90％A；1.5～3.0min，90％A；3.0～3.5min，90％A～10％A；3.5～5.0min，10％A；
质谱条件：电喷雾离子源ESI+；多反应检测MRM模式；Inter...

【专利技术属性】
技术研发人员：董茂锋，韩铮，唐红霞，郭文博，聂冬霞，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31