CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用制造技术

本发明专利技术属于鱼类免疫技术领域，具体涉及CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。本发明专利技术还提供包含表达CD40蛋白的核苷酸序列的表达载体在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。本发明专利技术又提供CD40蛋白胞外段或包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的表达载体在制备抵御罗非鱼抗链球菌感染的制品中的应用和在制备降低罗非鱼体内的链球菌载量的制品中的应用。本发明专利技术通过在罗非鱼体内过表达罗非鱼CD40蛋白胞外段来增强罗非鱼抗链球菌的能力，使得感染链球菌的罗非鱼的死亡率降低28％。另外，本发明专利技术通过在罗非鱼体内过表达CD40还可以降低罗非鱼体内的链球菌载量。

【技术实现步骤摘要】
CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用
本专利技术属于鱼类免疫
，具体涉及CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。
技术介绍
罗非鱼，隶属于鲈形目，罗非鱼属，具有生长快、繁殖力高等特点，适合集约化养殖，并且罗非鱼产品价格适中，深受广大消费者青睐，是联合国粮农组织推荐养殖的优质鱼类。我国是世界上最大的罗非鱼养殖生产国，罗非鱼产业对于我国乃至世界的粮食供应都有十分重要的意义。然而，近年来，罗非鱼病害频发，尤其是链球菌病的流行，严重阻碍了罗非鱼产业的健康发展。据调查，以往多用氟苯尼考来控制罗非鱼链球菌的流行，但近年来的病害来势凶猛，加上耐药菌株的出现，导致药物控制效果差，养殖业损失惨重。因此，探索安全有效的链球菌防控措施对于拯救罗非鱼养殖业显得至关重要。目前，在国内已有一些与链球菌防控的相关专利。例如，申请号为201710686718.4的中国专利技术专利“一种无乳链球菌WC1535△cps及其构建和应用”公开了一种鱼链球菌病的弱毒活疫苗；申请号为201310375813.4的中国专利技术专利“一种抑制链球菌和/或预防链球菌感染的疫苗”公开了一种融合蛋白疫苗，该疫苗能够显著提高Th17细胞活化的水平，达到阻止病原菌定居和迅速清除病原菌的作用；申请号为201410087045.7的中国专利技术专利“罗非鱼源无乳链球菌弱毒株及应用”公开了一种防治罗非鱼链球菌病的弱毒活疫苗；申请号为201410121138.7的专利技术专利“一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方法”公开了一种链球菌口服疫苗。然而，链球菌是典型的胞内细菌，能够逃避宿主吞噬细胞的杀灭，进而在机体内广泛传播。由于灭活疫苗免疫保护率较低，亚单位疫苗的制作成本较高，且以上疫苗也都无法有效诱导机体的细胞免疫，因此免疫效果并不甚理想。CD40是肿瘤坏死因子超家族成员，属于I型跨膜糖蛋白，在B细胞的活化、分化、Ig的分泌及类型转换，T细胞的激发、定向分化，抗原呈递细胞的激发、分化及功能调节等方面起关键作用。CD40在机体免疫应答反应中执行生物学效应的前提是与其特异性配体CD40L结合形成共刺激途径。当机体受到抗原刺激时，由抗原呈递细胞表面的组织相容复合物作为第一信号，促使T细胞上调表达CD40L，然后CD40与CD40L结合，并开启特异性免疫应答的“序幕”，激活抗原呈递细胞表面的其他粘附分子，由这些分子为T细胞的激活提供第二信号，从而产生效应及记忆细胞，放大免疫效应功能。然而，目前罗非鱼CD40对无乳链球菌的免疫应答还未见报道。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有技术中罗非鱼链球菌疫苗不能有效诱导机体细胞免疫的问题，提供CD40蛋白或包含表达CD40蛋白的核苷酸序列的表达载体在制备提高罗非鱼(Oreochromsmossambcus)抗链球菌免疫力制品中的应用，该方法进一步通过过表达尼罗罗非鱼CD40胞外段来增强罗非鱼抗链球菌的能力。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：本专利技术首先提供CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。具体可将制品通过向罗非鱼体内注射的方式使用。CD40是尼罗罗非鱼肿瘤坏死超家族成员，CD40基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示。本专利技术还提供包含表达CD40蛋白的核苷酸序列的表达载体在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。所述的表达载体可以是真核表达载体。包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的真核表达载体的制备，包括以下步骤：(1)提取尼罗罗非鱼脾脏总RNA，(2)合成cDNA第一链，(3)克隆尼罗罗非鱼CD40基因全长，(4)扩增CD40胞外段的cDNA序列，(5)构建含CD40胞外段的cDNA的重组真核表达质粒。表达CD40胞外段的真核表达载体可以为pcDNA3.1-CD40EC或pEGFP-N1-CD40EC，其中CD40EC是指CD40基因的胞外段序列；其中pcDNA3.1是指pcDNA3.1质粒，其中pEGFP-N1是指pEGFP-N1质粒。作为优选方案，可将CD40蛋白胞外段或包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的表达载体用于制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中。进一步的，表达CD40胞外段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。本专利技术还提供了CD40蛋白胞外段或包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的真核表达载体在制备抵御罗非鱼链球菌感染的制品中的应用。本专利技术还提供了CD40蛋白胞外段或包含表达CD40蛋白胞外段的核苷酸序列的真核表达载体在制备降低罗非鱼体内的链球菌载量的制品中的应用。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供CD40蛋白或包含表达CD40蛋白的核苷酸序列的真核表达载体在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用，作为优选方案，可以将CD40胞外段或包含表达CD40胞外段的核苷酸序列的表达质粒用于该制品的制备，通过体内注射方式用于罗非鱼，该制品制备简单易操作，成本低。本专利技术通过在罗非鱼体内过表达尼罗罗非鱼CD40胞外段来增强罗非鱼抗链球菌的能力，使得感染无乳链球菌的罗非鱼的死亡率降低28％。另外，通过在罗非鱼体内过表达尼罗罗非鱼CD40胞外段还可以降低罗非鱼体内的无乳链球菌载量，由此可以看出，本专利技术技术方案可以有效诱导罗非鱼机体细胞免疫。附图说明图1重组质粒pEGFP-N1-CD40EC的电泳图，其中泳道1为pEGFP-N1-CD40EC重组质粒，泳道2为Marker:DL10000Marker。图2重组质粒pEGFP-N1和pEGFP-N1-CD40EC的表达验证结果，A:PBS空白对照组；B:pEGFP-N1对照组；C:pEGFP-N1-CD40EC组。图3过表达CD40胞外段明显降低无乳链球菌的致死率。图4过表达CD40胞外段后明显减少罗非鱼脾脏中的无乳链球菌载量。具体实施方式实施例1尼罗罗非鱼CD40基因的克隆1、尼罗罗非鱼脾脏总RNA的提取取健康的尼罗罗非鱼，于冰上麻醉3分钟，取脾脏组织，采用Trizol试剂提取其总RNA。2、cDNA第一链的合成取1μg尼罗罗非鱼脾脏总RNA样品进行DNA酶处理以去除基因组DNA的污染，利用全式金反转录试剂盒制备cDNA，所得产物置于-20℃保存备用。3、尼罗罗非鱼CD40基因全长的克隆根据已公布的尼罗罗非鱼全基因组数据(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/197)，设计用于扩增CD40基因的ORF片段的特异性引物CD40-F和CD40-R，分别如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示，利用引物扩增得到CD40基因的ORF，片段大小为933bp。切胶回收目的条带并纯化产物。将产物连接至pMD-18T载体，转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。经BLAST同源性分析表明，目的产物确为CD40基因的cDNA序列片段。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.CD40蛋白在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，表达CD40蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示。


3.包含表达CD40蛋白的核苷酸序列的表达载体在制备提高罗非鱼抗链球菌免疫力的制品中的应用。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体。


5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，表达CD40蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID.NO:1所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏洪丽，鲁义善，夏立群，樊慧敏，程俊，喻大鹏，龙梦，陈文捷，
申请(专利权)人：广东海洋大学深圳研究院，深圳义海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44