一种检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法技术

本发明专利技术公开了检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法，其包括，提纯AD7c‑NTP单克隆抗体1；制备单克隆抗体结合垫：将偶联AD7c‑NTP单克隆抗体1的荧光微球喷涂于聚酯膜上，制得单克隆抗体结合垫；制备硝酸纤维素包被膜：将AD7c‑NTP单克隆抗体2、标记抗体IgG喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测带及质控带抗体；制备样品垫。本发明专利技术能够实现快速、单人份定量检测，且灵敏度高、误差小、检测限低，为临床使用提供了极大的便利。

【技术实现步骤摘要】
一种检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法
本专利技术属于阿尔茨海默病免疫荧光层析试纸制备方法
，具体涉及一种检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法。
技术介绍
阿尔茨海默症(Alzheimer'sdisease，AD，又叫老年性痴呆)是一种起病隐袭、进行性发展的慢性神经退行性疾病，是一种严重的智力致残症。随着人口老龄化的高速发展，AD已成为继心脏病、癌症、中风之后，导致老年人死亡的第四大病因，也是花费最多的三种疾病之一(仅次于肿瘤和心脏病)。病人从轻度记忆与认知障碍到最后的植物状态，要经历几年甚至几十年，这对病人和家属都是一个痛苦的过程。AD不是自然衰老，是疾病，早发现，早干预，早治疗，至关重要。阿尔茨海默症相关神经丝蛋白(AD-associatedneuronalthreadprotein，AD7C-NTP)是一种安全、有效的生物标记物，在AD诊断有着重要意义，具有广阔的应用前景。AD7C-NTP隶属于神经丝蛋白家族，是一种相对分子质量为41000的跨膜磷蛋白。AD7C-NTP自神经元胞体中表达后，广泛存在于神经细胞发生的轴突中，并大量出现在AD患者脑中的NFTs里，呈分泌性上调表达。研究表明，AD7C-NTP在神经元中的沉积在神经元变性早期即可出现，并且发生在NFTs形成之前，在早期AD患者的脑组织抽提物、脑脊液、尿液中均可以检测到AD7C-NTP。同时AD7C-NTP含量水平随病程延长和痴呆严重程度呈正相关逐渐增高，这可能是由于AD患者脑组织NTP免疫活性及信使RNA表达增强，导致神经元细胞凋亡增多，继而使死亡细胞释放大量的AD7C-NTP。神经元胞体和神经突触的丢失、神经元结构蛋白功能受损等病理过程，可以使AD7C-NTP表达升高。血液检测Aβ和Tau蛋白虽然微创、快速、便捷，但迄今为止其敏感性和特异性较难达到诊断要求。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。作为本专利技术其中一个方面，本专利技术提供一种检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法，其包括，提纯AD7c-NTP单克隆抗体1；制备单克隆抗体结合垫：将偶联AD7c-NTP单克隆抗体1的荧光微球喷涂于聚酯膜上，制得单克隆抗体结合垫；制备硝酸纤维素包被膜：将AD7c-NTP单克隆抗体2、标记抗体IgG喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测带及质控带抗体；制备样品垫。作为本专利技术所述的检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法的一种优选方案：所述提纯AD7c-NTP单克隆抗体1，为4℃条件下，用浓度为0.05mol/L，pH值为7.2～7.6的磷酸缓冲溶液对AD7c-NTP单克隆抗体1进行透析提纯处理；所述AD7c-NTP单克隆抗体1，选自商品化抗体ADJ700912。作为本专利技术所述的检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法的一种优选方案：所述荧光微球为包裹有荧光染料且表面修饰有氨基或羧基的聚苯乙烯球，其平均粒径为200nm。作为本专利技术所述的检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法的一种优选方案：所述制备单克隆抗体结合垫，其为，首先用浓度为0.05mol/L，pH值为7.4的MES冲溶液对荧光微球进行洗涤处理，并将荧光微球质量浓度调整为1％，然后用碳二亚胺和N-羟基琥珀亚酰胺共价偶联的方式将AD7c-NTP单克隆抗体1标记在所述荧光微球上；再使用定量喷膜仪以4μl/cm2的量将标记有AD7c-NTP单克隆抗体1喷涂于聚酯膜上，抗体与微球的质量比例1：20～80，避光条件下35～38℃烘干1小时，制得单克隆抗体结合垫，加入干燥剂封存备用。作为本专利技术所述的检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法的一种优选方案：所述制备硝酸纤维素包被膜，为使用含有1wt％蔗糖的浓度为0.05mol/L，pH值为7.4的磷酸缓冲溶液分别将AD7c-NTP单克隆抗体2、兔抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml的浓度，再使用定量喷膜仪以1μl/cm2的量将二者间隔喷涂在硝酸纤维素膜上，37℃烘干1小时，加入干燥剂封存备用；所述AD7c-NTP单克隆抗体2，选自商品化抗体ADH800134。作为本专利技术所述的检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法的一种优选方案：所述制备样品垫，为用含有1wt％BSA、0.1wt％tritonx-100的浓度为0.02mol/L，pH值为7.4的磷酸缓冲溶液浸泡玻璃纤维素膜1h，37℃烘干3h，制得样品垫。作为本专利技术所述的检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法的一种优选方案：所述共价偶联，其步骤为，配置50mM的MES反应缓冲溶液，pH值为6.0；将单克隆抗体1溶解于反应缓冲液中，蛋白浓度为10mg/ml；用反应缓冲液稀释微球，使其浓度为1％(w/v)；将单克隆抗体1与微球混合，混合后在室温培育20分钟；用去离子水配制EDAC溶液，浓度为10mg/ml；量取EDAC溶液加到单克隆抗体1与微球的混合液中；用0.1M的氢氧化钠溶液调整反应溶液的pH值至6.5，混合后在室温摇床上培育2小时；将未结合的抗体除去，放4℃冷藏冰箱待用。本专利技术的有益效果：本专利技术所提供的检测AD7c-NTP的荧光免疫层析试剂条以荧光微球为信号源，能够实现快速、单人份定量检测，且灵敏度高、误差小，为临床使用提供了极大的便利。本专利技术所提供的检测AD7c-NTP的荧光免疫层析试纸条，制备方法简单，可实现批量生产。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1为图1是本专利技术所述一种检测AD7c-NTP的试剂条的结构示意图；图2是本专利技术所述一种检测AD7c-NTP的试纸条设置在底座上的主视图；图3是本专利技术所述试纸条的侧视图。图中附图标记表示为：1-底座、2-卡盖、3-试纸条、4-底板、5-样品垫、6-单克隆抗体结合垫、7-硝酸纤维素包被膜、8-吸水纸、9-检测带、10-观察口、11-质控带、12-加样口。图4为本专利技术检测AD7c-NTP的试剂的标准曲线图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：包括，/n提纯AD7c-NTP单克隆抗体1；/n制备单克隆抗体结合垫：将偶联AD7c-NTP单克隆抗体1的荧光微球喷涂于聚酯膜上，制得单克隆抗体结合垫；/n制备硝酸纤维素包被膜：将AD7c-NTP单克隆抗体2、标记抗体IgG喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测带及质控带抗体；/n制备样品垫。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：包括，
提纯AD7c-NTP单克隆抗体1；
制备单克隆抗体结合垫：将偶联AD7c-NTP单克隆抗体1的荧光微球喷涂于聚酯膜上，制得单克隆抗体结合垫；
制备硝酸纤维素包被膜：将AD7c-NTP单克隆抗体2、标记抗体IgG喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测带及质控带抗体；
制备样品垫。


2.如权利要求1所述的检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：所述提纯AD7c-NTP单克隆抗体1，为4℃条件下，用浓度为0.05mol/L，pH值为7.2～7.6的磷酸缓冲溶液对AD7c-NTP单克隆抗体1进行透析提纯处理；所述AD7c-NTP单克隆抗体1，选自商品化抗体ADJ700912。


3.如权利要求1或2所述的检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：所述荧光微球为包裹有荧光染料且表面修饰有氨基或羧基的聚苯乙烯球，其平均粒径为200nm。


4.如权利要求3所述的检测尿液中阿尔茨海默病相关神经丝蛋白的荧光免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：所述制备单克隆抗体结合垫，其为，首先用浓度为0.05mol/L，pH值为7.4的MES冲溶液对荧光微球进行洗涤处理，并将荧光微球质量浓度调整为1％，然后用碳二亚胺和N-羟基琥珀亚酰胺共价偶联的方式将AD7c-NTP单克隆抗体1标记在所述荧光微球上；再使用定量喷膜仪以4μl/cm2的量将标记有AD7c-NTP单克隆抗体1喷涂于聚酯膜上，抗体与微球的质量比例1：20～80，避光条件下35～38...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋为，周衍，周彬，丁兆生，刘熙，林马明，陈啸，张嘉玮，
申请(专利权)人：江苏省荣军医院，无锡市江原实业技贸总公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32