鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法技术

本发明专利技术涉及鱼粉的质量检测，尤其涉及鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法，包括以下步骤，步骤一，样品处理，称取待检测鱼粉4g，溶于100ml去离子水中，用玻璃棒搅拌5‑8min后静置30min，取上清液，离心沉淀，得到沉淀物；步骤二，DNA提取，提取沉淀物的DNA；步骤三，PCR扩增，将沉淀物的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；步骤四，电泳检测，制备含有琼脂糖的凝胶成型器，插入成型梳，加入溴化乙锭，加入PCR扩增产物，电源，调压至4‑5V/cm，电泳30min，拍照，根据照片判断鱼粉中是否存在家禽组织，准确性高、成本低、效率高。

【技术实现步骤摘要】
鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法
本专利技术涉及鱼粉的质量检测，尤其涉及鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法。
技术介绍
鱼粉是饲料中最常用的动物性蛋白质来源，其品质好坏决定了饲料质量的优劣。近年来，鱼粉掺杂现象日趋严重，各地抽（送）检样品中均不同程度上掺有各种非鱼粉物质，如羽毛粉、皮革粉、血粉和骨粉等；而且鱼粉掺假不仅花样繁多，手段也日趋隐蔽；掺假鱼粉与合格鱼粉的外观形态相近，肉眼不易发觉。一些文献报道的用纯/粗蛋白比值法，显微镜检测观察，以及漂浮、碱溶解、沉淀、显色等物理或化学方法来判断鱼粉品质优劣，只能作为快速鉴别的初步方法，还不能进行全面、客观的检测分析。目前直接通过分子生物学方法，确定鱼粉中是否掺杂羽毛粉的分子生物学方法还没有报道，我们通过实验室的仪器设备，建立鱼粉中掺假羽毛粉的分子生物学检测方法，就显得十分重要。我们通过建立的分子生物学方法，直接从鱼粉中检测含有家禽羽毛的分子标记特征，以没有参假的鱼粉作为对照，可以作为鱼粉掺杂羽毛粉的直接证据，为优质鱼粉的销售提供价格保障依据。本专利技术方法能保证研相关饲料检测机构、饲料企业从鱼粉中检测到掺杂羽毛粉的分子生物学证据，为饲料原料品质提供有效的保障方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种通过分子生物学方法确定鱼粉是否存在家禽组织的鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法，包括以下步骤，步骤一，样品处理，称取待检测鱼粉4g，溶于100ml去离子水中，用玻璃棒搅拌5-8min后静置30min，取上清液，离心沉淀，得到沉淀物；步骤二，DNA提取，提取沉淀物的DNA；步骤三，PCR扩增，将沉淀物的DNA进行PCR扩增，其中正向引物GAPDH-F：5′-CACTGCTGCCCTCTTCCTC-3′，反向引物GAPDH-R：5′-ATCCACATCGCAACTTCAT-3′，得到PCR扩增产物；步骤四，电泳检测，制备含有琼脂糖的凝胶成型器，插入成型梳，加入溴化乙锭，加入PCR扩增产物，电源，调压至4-5V/cm，电泳30min，拍照，根据照片判断鱼粉中是否存在家禽组织。进一步地，步骤二中，提取沉淀物的DNA包括以下步骤，A，取0.5mg沉淀物放入1.5ml的灭菌离心管中，加入200ul缓冲液GA后进行裂解；B，向步骤A处理过的离心管中加入20ulProteinaseK溶液，混匀，56℃消化过夜；C，向步骤B处理过的离心管中加入200ul缓冲液GB，颠倒摇混合1min，70℃放置10min，至溶液变清亮，离心以去除离心管内壁的水珠；D，向步骤C处理过的离心管中加入200ul无水乙醇，振荡混合15s，离心管中出现絮状沉淀，离心以去除离心管内壁的水珠；E，将步骤D处理过的物料转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉废液；F，向步骤E处理过的吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液；G，向步骤F处理过的吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液；H，将步骤G处理过的吸附柱CB3室温放置，至漂洗液被晾干；J，将步骤H处理过的吸附柱CB3转入离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，得到含有DNA的溶液；K，将步骤J获得的含有DNA的溶液通过DNA试剂盒提取，得到沉淀物的DNA。进一步地，步骤三中，将沉淀物的DNA进行PCR扩增包括以下步骤，a，向13.5ulPCR反应混合物中加入1ul沉淀物的DNA、正向引物0.5ul、反向引物0.5ul、双蒸水9.5ul，得到25ul的PCR扩增反应体系；b，在94℃条件下预变性3min；c，在94℃条件下变性30s；d，在60℃条件下退火30s；e，在72℃条件下延伸20s；f，35个循环后，在72℃条件下延伸10min，4℃条件下保存备用。进一步地，步骤四中，电泳检测包括以下步骤，Ⅰ，准备凝胶成型器，插入成型梳；Ⅱ，将1.5g琼脂糖加至100mL1×TAE缓冲液中，摇匀，在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化，加入5ul溴化乙锭至熔化的琼脂糖液中混匀，冷却至60℃以下；Ⅲ，将冷却的琼脂糖倒入凝胶成型器，制备凝胶，待凝胶变硬且呈不透明乳白色，取出成型梳；Ⅳ，将凝胶置于电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm；Ⅴ，取2ul的6X载样缓冲液于封口膜上，再加入5ulPCR扩增产物，混匀后加入点样孔；Ⅵ，通电，调节电压至4-5V/cm，电泳30min，断电，把电泳凝胶放到凝胶成像系统中拍照保存；Ⅶ，观察照片，判断鱼粉中是否存在家禽组织。本专利技术的有益效果在于：对掺杂羽毛粉的鱼粉，直接通过分子生物学方法，确定鱼粉中掺杂羽毛粉的分子生物学证据，建立从鱼粉中查找含有家禽组织（羽毛粉）的方法，可以作为鱼粉掺杂羽毛粉的直接证据，为优质鱼粉的销售提供价格保障依据。本专利技术创造可以准确的检测到鱼粉中掺杂家禽组织成分（羽毛）存在的效果。本专利技术创造可以克服难以用肉眼、纯/粗蛋白比值法、显微镜检测观察、以及漂浮、碱溶解、沉淀、显色等物理或化学方法判断鱼粉掺杂家禽组织成分（羽毛）的优点，只要能在鱼粉中提取出的DNA，扩增出目的条带，就可以判定鱼粉中掺杂有羽毛粉的事实，通过对本专利技术DNA分子条带的检测，能知道鱼粉中是否掺杂家禽组织（羽毛粉）的结果，从而能有目的对鱼粉饲料品质进行评价和估计，提高其在动物饲料配合中的价值和效率，在饲料配合程中选择没有检测到的目的条带的鱼粉，可提高动物采食后饲料营养成分的利用率，增强动物的体重等生长指标。另外，本专利技术所使用的鉴别方法准确性高、成本低、效率高。附图说明图1为实施例1琼脂糖凝胶电泳检测；图2为鸡的GAPDH与鱼的GAPDH比对结果；图3为实施例2琼脂糖凝胶电泳检测。具体实施方式下面将结合专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。以下各实施例中，DNA试剂盒选用天根生化科技（北京）有限公司的TIANampTissueDNA试剂盒。步骤二中，提取沉淀物的DNA包括以下步骤，A，取0.5mg沉淀物放入1.5ml的灭菌离心管中，加入200ul缓冲液GA后进行裂解，该步骤中在加入缓冲液的同时还可以加入浓度为100mg/mL的RNaseA溶液4ul，振荡15s后，室温置放5min进行裂解；B，向步骤A处理过的离心管中加入20ulProteinaseK溶液，混匀，56℃消化过夜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤，/n步骤一，样品处理，称取待检测鱼粉4g，溶于100ml去离子水中，用玻璃棒搅拌5-8min后静置30min，取上清液，离心沉淀，得到沉淀物；/n步骤二，DNA提取，提取沉淀物的DNA；/n步骤三，PCR扩增，将沉淀物的DNA进行PCR扩增，其中正向引物GAPDH-F：5′-CACTGCTGCCCTCTTCCTC-3′，反向引物GAPDH-R：5′-ATCCACATCGCAACTTCAT-3′，得到PCR扩增产物；/n步骤四，电泳检测，制备含有琼脂糖的凝胶成型器，插入成型梳，加入溴化乙锭，加入PCR扩增产物，电源，调压至4-5V/cm，电泳30min，拍照，根据照片判断鱼粉中是否存在家禽组织。/n

【技术特征摘要】
1.一种鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤，
步骤一，样品处理，称取待检测鱼粉4g，溶于100ml去离子水中，用玻璃棒搅拌5-8min后静置30min，取上清液，离心沉淀，得到沉淀物；
步骤二，DNA提取，提取沉淀物的DNA；
步骤三，PCR扩增，将沉淀物的DNA进行PCR扩增，其中正向引物GAPDH-F：5′-CACTGCTGCCCTCTTCCTC-3′，反向引物GAPDH-R：5′-ATCCACATCGCAACTTCAT-3′，得到PCR扩增产物；
步骤四，电泳检测，制备含有琼脂糖的凝胶成型器，插入成型梳，加入溴化乙锭，加入PCR扩增产物，电源，调压至4-5V/cm，电泳30min，拍照，根据照片判断鱼粉中是否存在家禽组织。


2.根据权利要求1所述的鱼粉中家禽组织的DNA分子检测方法，其特征在于，步骤二中，提取沉淀物的DNA包括以下步骤，
A，取0.5mg沉淀物放入1.5ml的灭菌离心管中，加入200ul缓冲液GA后进行裂解；
B，向步骤A处理过的离心管中加入20ulProteinaseK溶液，混匀，56℃消化过夜；
C，向步骤B处理过的离心管中加入200ul缓冲液GB，颠倒摇混合1min，70℃放置10min，至溶液变清亮，离心以去除离心管内壁的水珠；
D，向步骤C处理过的离心管中加入200ul无水乙醇，振荡混合15s，离心管中出现絮状沉淀，离心以去除离心管内壁的水珠；
E，将步骤D处理过的物料转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉废液；
F，向步骤E处理过的吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液；
G，向步骤F处理过的吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液；
H，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨广礼，刘俊美，丁瑜，陈建成，韩进诚，潘凤华，
申请(专利权)人：河南正本清源科技发展股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41