组成型分泌表达O型FMDV重组抗原表位基因工程CHO细胞系的构建方法技术

本发明专利技术涉及组成型分泌表达O型FMDV重组抗原表位基因工程CHO细胞系的构建方法，属于基因工程领域，以SCGB1D1 isoform信号肽和重新串联的OME2为元件，以HBcAg为骨架，设计信号肽‑HBcAg‑OME2融合基因，构建包含所述融合基因的供体质粒，利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将携带信号肽‑HBcAg‑OME2的融合基因整合到CHO细胞染色体的HPRT次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因和8号染色体端粒区，构建的基因工程CHO细胞能组成型分泌表达FMD重组抗原，为将来实现大量组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原提供了技术平台和基因工程CHO细胞系，具有重要的经济价值。

【技术实现步骤摘要】
组成型分泌表达O型FMDV重组抗原表位基因工程CHO细胞系的构建方法
本专利技术属于基因工程
，具体地，涉及一种基因工程CHO细胞系的构建方法。
技术介绍
HBcAg作为抗原表位展示载体，重组蛋白可自组装成天然病毒样颗粒(VLP)。因此，利用该HBcAg作为载体展示外源抗原表位，不仅可以使抗原表位展示在病毒样颗粒的表面，诱导体液免疫反应，而且可以通过激活模式识别受体(PRRS)激发固有免疫和细胞免疫反应。但原核(E.coli)系统表达的HBcAg外源蛋白常常是包涵体，不能折叠组装成天然病毒样颗粒，需要对包涵体变性溶解，复性等一系列的处理过程，实现重组蛋白的重新折叠组装。这种组装不仅过程复杂，而且组装过程受到缓冲系统，孵育时间，蛋白浓度、溶液离子强度、环境温度等条件的影响，VLP产量低，成本高，不适合大规模生产。因此，开发能可溶性表达，细胞内组装VLP的重组表达系统显得尤为重要。CHO细胞作为目前生产各种医用治疗性生物制剂的最广泛的真核细胞表达系统(Renneretal.,1995)，不仅可以实现重组蛋白的可溶性表达，保证其天然结构，而且可以对表达蛋白进行修饰，最大化保证重组蛋白的生物学与免疫学功能。但是CHO细胞常常以瞬时形式表达重组蛋白，而且表达量低，导致生产成本非常高，用于生产医用生物制剂尚可，但不适宜生产兽用疫苗用重组抗原或生物试剂。
技术实现思路
为了解决现有技术中的不足，本专利技术的目的一在于提供一种O型FMDV抗原表位基因OME2，目的二在于提供一种重组蛋白信号肽-HBcAg-OME2基因，目的三在于提供包含所述信号肽-HBcAg-OME2基因的重组载体，目的四在于提供分泌表达所述信号肽-HBcAg-OME2重组蛋白的基因工程CHO细胞系，目的五在于提供所述基因工程CHO细胞系的构建方法。利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将携带SCGB1D1isoform-HBcAg-OME2的融合基因整合到CHO细胞染色体的HPRT次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因或8号染色体端粒区，构建携带SCGB1D1isoform-HBcAg-OME2融合基因的基因工程CHO细胞，为实现组成型可持续表达重组蛋白奠定了基础。为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：一种O型FMDV重组抗原表位OME2，其特征在于：将PADRET细胞淋巴表位命名为E4、将GenBank:AAK62010.1中O型口蹄疫VP1第135-160位氨基酸命令为E5、将GenBank:AF506822.2中O型口蹄疫VP1第200-213位氨基酸命名为E6、将GenBank:JN998085.1中O型口蹄疫VP1第135-160位氨基酸命名为E7；所述抗原表位基因OME2是将E4、E5、E6、E7和E6依次串联所得。一种重组蛋白信号肽-HBcAg-OME2，是将SCGB1D1isoform信号肽、HBcAg1-78氨基酸段、所述的抗原表位基因OME2和HBcAg81-149氨基酸段依次串联所得。进一步地，在HBcAg1-78氨基酸段N末端和HBcAg81-149氨基酸段C末端分别添加6×His标签。一种重组载体，包含上述信号肽-HBcAg-OME2基因的核苷酸序列。一种组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原的CHO细胞系，在CHO细胞HPRT基因2号外显子，或在CHO细胞8号染色体端粒区LOC100761280外显子和Etfbkmt基因之间的内含子区域，定点插入所述信号肽-HBcAg-OME2基因。所述CHO细胞系的构建方法，包括以下步骤：步骤一、构建打靶质粒：根据HPRT2号外显子的基因序列和8号染色体端粒区内含子序列分别设计sgRNA，将所述sgRNA与pSpCas9(BB)-2A-Puro载体连接分别构建打靶质粒，得到HPRT打靶质粒和8号染色体端粒区打靶质粒；所述HPRT的sgRNA为H-2、H-6或H-7，其中：H-2：GTGGCCCTCTGTGTGCTGAA，H-6：AGCCCCCCTTCAGCACACAG，H-7：CTGATAAAATCTACAGTCAT；所述8号染色体端粒区的sgRNA为8-6、8-7或8-10，其中：8-6：TGAATGGCACCATGTCACAC，8-7：TCAGAGATGAAATTAATAAG，8-10：CGTTGATTTAAGTTCCTTAA；步骤二、构建供体质粒：根据打靶位点确定同源臂序列；将所述同源臂序列与信号肽-HBcAg-OME2基因序列相连，通过添加载体元件并插入PMD19-T载体构建供体质粒，由此分别得到HPRT供体质粒H-19T和8号染色体端粒区供体质粒8-19T；步骤三、瞬时转染供体质粒验证表达：将HPRT供体质粒和8号染色体端粒区供体质粒分别转染CHO细胞，验证是否转染成功并表达目的蛋白；若转染成功并表达目的蛋白，继续进行下一步骤；步骤四、共转染打靶质粒和供体质粒加压筛选阳性克隆：将供体质粒H-19T和8-19T分别酶切线性化，得到线性化供体质粒H-19T和线性化供体质粒8-19T；将步骤一所得HPRT打靶质粒与所述线性化供体质粒H-19T混合后得到混合物Ⅰ，将步骤一所得8号染色体端粒区打靶质粒与所述线性化供体质粒8-19T混合后得到混合物Ⅱ；将所述混合物Ⅰ和混合物Ⅱ分别转染CHO细胞，利用CSRISP/Cas9同源重组技术，使信号肽-HBcAg-OME2融合基因与CHO细胞基因组发生同源重组，经筛选获取阳性克隆，得到组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原的CHO细胞系。作为对上述方案的进一步优化，步骤二所述添加载体元件是以PEF1α启动子启动信号肽-HBcAg-OME2基因、在信号肽-HBcAg-OME2后添加SV40PolyA、以PCMV启动子启动筛选基因EGFP和PURO并在所述筛选基因后添加SV40PolyA。作为对上述方案的进一步优化，步骤二所述HPRT供体质粒，是以CHO细胞HPRT基因2号外显子为打靶位点，选择所述打靶位点两侧各750bp序列为同源臂序列，将所述同源臂序列与信号肽-HBcAg-OME2基因相连后插入载体所得。作为对上述方案的进一步优化，步骤二所述8号染色体端粒区供体质粒，是以CHO细胞8号染色体端粒区LOC100761280外显子和Etfbkmt基因之间内含子区域为打靶位点，选择所述打靶位点两侧各750bp序列为同源臂序列，将所述同源臂序列与信号肽-HBcAg-OME2基因相连后插入载体所得。有益效果：本专利技术以SCGB1D1isoform信号肽和重新串联的O型FMDV抗原表位(OME2)为元件，能自组装病毒样颗粒(VLP)的HBcAg为骨架，设计SCGB1D1isoform-HBcAg-OME2融合基因，构建携带SCGB1D1isoform-HBcAg-OME2融合基因的供体质粒，利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将携带SCGB1D1isoform-HBcAg-OME2的融合基因整合到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种O型FMDV重组抗原表位OME2，其特征在于：将PADRE T细胞淋巴表位命名为E4、将GenBank: AAK62010.1中O型口蹄疫VP1第135-160位氨基酸命令为E5、将GenBank:AF506822.2中O型口蹄疫VP1第200-213位氨基酸命名为E6、将GenBank:JN998085.1中O型口蹄疫VP1第135-160位氨基酸命名为E7；所述重组抗原表位OME2是将E4、E5、E6、E7和E6依次串联所得。/n

【技术特征摘要】
1.一种O型FMDV重组抗原表位OME2，其特征在于：将PADRET细胞淋巴表位命名为E4、将GenBank:AAK62010.1中O型口蹄疫VP1第135-160位氨基酸命令为E5、将GenBank:AF506822.2中O型口蹄疫VP1第200-213位氨基酸命名为E6、将GenBank:JN998085.1中O型口蹄疫VP1第135-160位氨基酸命名为E7；所述重组抗原表位OME2是将E4、E5、E6、E7和E6依次串联所得。


2.一种重组蛋白信号肽-HBcAg-OME2，是将SCGB1D1isoform信号肽、HBcAg1-78氨基酸段、所述的抗原表位基因OME2和HBcAg81-149氨基酸段依次串联所得。


3.根据权利要求2所述的一种重组蛋白信号肽-HBcAg-OME2，其特征在于：在HBcAg1-78氨基酸段N末端和HBcAg81-149氨基酸段C末端分别添加6×His标签。


4.一种重组载体，包含如权利要求2或3所述的信号肽-HBcAg-OME2的核苷酸序列。


5.一种组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原的CHO细胞系，其特征在于：在CHO细胞HPRT基因2号外显子，或在CHO细胞8号染色体端粒区LOC100761280外显子和Etfbkmt基因之间的内含子区域，定点插入权利要求2或3所述的信号肽-HBcAg-OME2的基因。


6.如权利要求5所述的CHO细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、构建打靶质粒：根据HPRT2号外显子的基因序列和8号染色体端粒区内含子序列两个打靶位点分别设计sgRNA，将所述sgRNA与pSpCas9（BB）-2A-Puro载体连接分别构建打靶质粒，得到HPRT打靶质粒和8号染色体端粒区打靶质粒；
所述HPRT的sgRNA为H-2、H-6或H-7，其中：
H-2：GTGGCCCTCTGTGTGCTGAA，
H-6：AGCCCCCCTTCAGCACACAG，
H-7：CTGATAAAATCTACAGTCAT；
所述8号染色体端粒区的sgRNA为8-6、8-7或8-10，其中：
8-6：TGAATGGCACCATGTCACAC，
8...

【专利技术属性】
技术研发人员：常惠芸，孙振文，邵军军，常艳燕，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62