PVA膜固定化酶及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种PVA膜固定化酶及其制备方法。该PVA膜固定化酶包括PVA多孔膜和包埋在PVA多孔膜上的酶，PVA多孔膜为三维结构化PVA多孔膜，酶选自转氨酶、D‑乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、醇脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖1‑脱氢酶及它们的突变体中的任意一种。采用三维结构化PVA多孔膜作为载体将酶以包埋的方式固定化，包埋固定化的流程简单、条件温和、比表面积大，酶被包埋固定化在PVA多孔膜中后比较稳定，不容易在使用过程中浸出；所采用的PVA多孔膜的多孔结构能够更好地传递反应物和产物，适用于连续流动生化催化中使用，对酶具有广适性。

【技术实现步骤摘要】
PVA膜固定化酶及其制备方法
本专利技术涉及酶固定化
，具体而言，涉及一种PVA膜固定化酶及其制备方法。
技术介绍
生物催化正在成为化学品、中间体、精细化学品和最终药物分子制造计划的组成部分。然而，随着工艺需求的不断扩大，酶应用的效率和经济性变得不可避免。因此，这不仅需要增强酶活性、特异性和生产力，还需要提高保质期和可回收性，特别是为了促进商业规模应用的经济可行性。酶固定平台为生产过程中适宜地整合酶提供了一种优秀的工具。多年来，已经评估了几种天然和合成载体对的酶固定效率，比如每个平台都根据其应用、经济和优势进行了专门评估。固定化生物催化剂在有机合成、污染控制和以诊断为目的等领域具有广泛的应用（EnzymeMicrobTechnol，31,171-8;JPharmSci，89,979-90）。通过将酶固定到固体载体上或固体载体内来实现固定化，由此获得非均相固定化酶系统。酶可以通过多种方法固定，包括物理方式（载体和酶之间存在微弱的相互作用）以及化学方式（载体与酶形成共价键）（Analyst，133,697-701;ChemSocRev，40,2567-92;柏林海德堡：Springer，95-126。）或两者的组合，从而包含各种功能活性的载体。酶的物理固定方法包括在膜或膜反应器内、在水不溶性基质上的吸附（物理，离子）比如在中孔材料上吸附、包含（或凝胶包埋）、用固体膜微囊化、用液膜微囊化、酶促Langmuir-Blodgett膜的形成（AnalChem，1994;66,1120A-7A）等。在膜包埋或包封的情况下，所得的酶催化剂取决于膜支持物的性质，例如亲水性、疏水性、反应性官能团密度、孔隙率、孔径分布、膜厚度、反应器配置等。固定化的固定方法基于酶在膜内的定位，其目的是除了在操作条件下高度稳定之外还实现酶的更高表达。目前，采用多孔膜固定化酶的研究有很多，但是，由于不同酶的结构和活性位点的不同，导致其固定化方法也有不同，比如在采用PVA膜（聚乙烯醇膜）固定脂肪酶时需要采用戊二醛进行交联，才能达到利用固定化改善脂肪酶稳定性和活性的目的。另外，在利用多孔膜固定化木聚糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶、β-半乳糖苷酶和抗坏血酸氧化酶等酶类时，通常也利用氨基、羧基、巯基、羟基、咪唑或酚基等基团将多孔膜和酶通过共价键进行结合。由此可见，现有技术中采用交联剂固定化酶时需要采用高纯度酶，导致固定化方法复杂、酶的负载量受限。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种PVA膜固定化酶及其制备方法，以解决现有技术中采用多孔膜固定化酶工艺复杂的问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种PVA膜固定化酶，该PVA膜固定化酶包括PVA多孔膜和包埋在PVA多孔膜上的酶，PVA多孔膜为三维结构化PVA多孔膜，酶选自转氨酶、D-乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、醇脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖1-脱氢酶及它们的突变体中的任意一种。进一步地，上述酶为游离酶或交联酶聚集体。进一步地，上述转氨酶为来源于ChromobacteriumviolaceumDSM30191的转氨酶或者来源于Arthrobactercitreus的转氨酶，或来源于B.thuringiensis的转氨酶，酮还原酶为来源于Acetobactersp.CCTCCM209061的酮还原酶，或者来源于CandidamacedoniensisAKU4588的酮还原酶；环己酮单加氧酶为来源于Rhodococcussp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonaspetroleovorans的环己酮单加氧酶，或者来源于Rhodococcusruber-SD1的环己酮单加氧酶；氨裂解酶为来源于AspergillusnigerCBS513.88的氨裂解酶和来源于Solenostemonscutellarioides的氨裂解酶；烯还原酶为来源于Saccharomycescerevisiae的烯还原酶和来源于Chryseobacteriumsp.CA49的烯还原酶；亚胺还原酶为来源于Streptomycessp的亚胺还原酶和Bacilluscereus的亚胺还原酶；氨基酸脱氢酶为来源于Bacilluscereus的亮氨酸脱氢酶和来源于Bacillussphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；腈水解酶为来源于AspergillusnigerCBS513.88的腈水解酶和来源于NeurosporacrassaOR74A的腈水解酶。进一步地，上述来源于ChromobacteriumviolaceumDSM30191的转氨酶具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第7位、第47位、第90位、第95位、第297位、第304位、第380位、第405位和第416位，且第7位的苏氨酸突变为半胱氨酸，第47位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第90位的赖氨酸突变为甘氨酸，第95位的丙氨酸突变为脯氨酸，第297位的异亮氨酸突变为亮氨酸，第304位的赖氨酸突变为天冬氨酸，第380位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第405位的精氨酸突变为谷氨酸，第416位的精氨酸突变为苏氨酸，或者转氨酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列。进一步地，上述来源于Arthrobactercitreus的转氨酶具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中突变至少包括以下突变位点之一：第3位、第5位、第60位、第164位、第171位、第178位、第180位、第186位、第187位、第252位、第370位、第384位、第389位、第404位、第411位、第423位和第424位，且第3位的亮氨酸突变为丝氨酸，第5位的缬氨酸突变为丝氨酸，第60位的半胱氨酸突变为酪氨酸，第164位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，第171位的谷氨酸突变为天冬氨酸，第178位的丙氨酸突变为亮氨酸，第180位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第186位的丝氨酸突变为甘氨酸，第187位的丝氨酸突变为丙氨酸，第252位的缬氨酸突变为异亮氨酸，第370位的亮氨酸突变为丙氨酸，第384位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第389位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，第404位的亮氨酸突变为谷氨酰胺，第411位的甘氨酸突变为天冬氨酸，第423位的甲硫氨酸突变为赖氨酸，第424位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，或者转氨酶的突变体的氨基酸序列具有发生突变得到的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变得到的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列。进一步地，上述来源于Acetobactersp.CCTCCM209061的酮还原酶具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列，酮还原酶的突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO.3所示的氨基酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PVA膜固定化酶，其特征在于，所述PVA膜固定化酶包括PVA多孔膜和包埋在所述PVA多孔膜上的酶，所述PVA多孔膜为三维结构化PVA多孔膜，所述酶选自转氨酶、D-乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、醇脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖1-脱氢酶及它们的突变体中的任意一种。/n

【技术特征摘要】
1.一种PVA膜固定化酶，其特征在于，所述PVA膜固定化酶包括PVA多孔膜和包埋在所述PVA多孔膜上的酶，所述PVA多孔膜为三维结构化PVA多孔膜，所述酶选自转氨酶、D-乳酸脱氢酶、环己酮单加氧酶、酮还原酶、烯还原酶、腈水解酶、氨裂解酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、醇脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖1-脱氢酶及它们的突变体中的任意一种。


2.根据权利要求1所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述酶为游离酶或交联酶聚集体。


3.根据权利要求1或2所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述转氨酶为来源于ChromobacteriumviolaceumDSM30191的转氨酶或者来源于Arthrobactercitreus的转氨酶，或来源于B.thuringiensis的转氨酶，所述酮还原酶为来源于Acetobactersp.CCTCCM209061的酮还原酶，或者来源于CandidamacedoniensisAKU4588的酮还原酶；所述环己酮单加氧酶为来源于Rhodococcussp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonaspetroleovorans的环己酮单加氧酶，或者来源于Rhodococcusruber-SD1的环己酮单加氧酶；所述氨裂解酶为来源于AspergillusnigerCBS513.88的氨裂解酶和来源于Solenostemonscutellarioides的氨裂解酶；所述烯还原酶为来源于Saccharomycescerevisiae的烯还原酶和来源于Chryseobacteriumsp.CA49的烯还原酶；所述亚胺还原酶为来源于Streptomycessp的亚胺还原酶和Bacilluscereus的亚胺还原酶；所述氨基酸脱氢酶为来源于Bacilluscereus的亮氨酸脱氢酶和来源于Bacillussphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；所述腈水解酶为来源于AspergillusnigerCBS513.88的腈水解酶和来源于NeurosporacrassaOR74A的腈水解酶。


4.根据权利要求3所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述来源于ChromobacteriumviolaceumDSM30191的转氨酶具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，所述转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以下突变位点之一：第7位、第47位、第90位、第95位、第297位、第304位、第380位、第405位和第416位，且第7位的苏氨酸突变为半胱氨酸，第47位的丝氨酸突变为半胱氨酸，第90位的赖氨酸突变为甘氨酸，第95位的丙氨酸突变为脯氨酸，第297位的异亮氨酸突变为亮氨酸，第304位的赖氨酸突变为天冬氨酸，第380位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第405位的精氨酸突变为谷氨酸，第416位的精氨酸突变为苏氨酸，或者所述转氨酶的突变体的氨基酸序列具有所述发生突变得到的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变得到的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列。


5.根据权利要求3所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述来源于Arthrobactercitreus的转氨酶具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，所述转氨酶的突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以下突变位点之一：第3位、第5位、第60位、第164位、第171位、第178位、第180位、第186位、第187位、第252位、第370位、第384位、第389位、第404位、第411位、第423位和第424位，且第3位的亮氨酸突变为丝氨酸，第5位的缬氨酸突变为丝氨酸，第60位的半胱氨酸突变为酪氨酸，第164位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，第171位的谷氨酸突变为天冬氨酸，第178位的丙氨酸突变为亮氨酸，第180位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第186位的丝氨酸突变为甘氨酸，第187位的丝氨酸突变为丙氨酸，第252位的缬氨酸突变为异亮氨酸，第370位的亮氨酸突变为丙氨酸，第384位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，第389位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，第404位的亮氨酸突变为谷氨酰胺，第411位的甘氨酸突变为天冬氨酸，第423位的甲硫氨酸突变为赖氨酸，第424位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，或者所述转氨酶的突变体的氨基酸序列具有所述发生突变得到的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变得到的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列。


6.根据权利要求3所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述来源于Acetobactersp.CCTCCM209061的酮还原酶具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列，所述酮还原酶的突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO.3所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以下突变位点之一：第94位、第144位和第156位，且第94位的丙氨酸突变为天冬酰胺，第144位的谷氨酸突变为丝氨酸，第156位的天冬酰胺突变为苏氨酸或缬氨酸，或者所述酮还原酶的突变体的氨基酸序列具有所述发生突变得到的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变得到的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列。


7.根据权利要求3所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述来源于Rhodococcussp.Phi1的环己酮单加氧酶具有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列，所述环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO.4所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以下突变位点之一：第280位、第435位、第436位、第438位、第441位、第508位和第510位，且第280位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，第435位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第436位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，第438位的亮氨酸突变为丙氨酸，第441位的丝氨酸突变为缬氨酸，第510位的亮氨酸突变为缬氨酸，或者所述环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列具有所述发生突变得到的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变得到的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列。


8.根据权利要求3所述的PVA膜固定化酶，其特征在于，所述来源于Rhodococcusruber-SD1的环己酮单加氧酶具有SEQIDNO.5所示的氨基酸序列，所述环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列是由SEQIDNO.5所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，其中所述突变至少包括以下突变位点之一：第45位、第190位、第249位、第257位、第393位、第504位和第559位，且第45位的甲硫氨酸突变为苏氨酸，第190位的脯氨酸突变为亮氨酸，第249位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第257位的半胱氨酸突变为丙氨酸，第393位的半胱氨酸突变为缬氨酸，第504位的脯氨酸突变为缬氨酸，第559位的酪氨酸突变为甲硫氨酸，或者所述环己酮单加氧酶的突变体的氨基酸序列具有所述发生突变得到的氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯·盖吉，肖毅，张娜，罗杰斯卡·维亚撒·威廉姆斯，崔瑜霞，赵佳东，高妍妍，
申请(专利权)人：凯莱英生命科学技术天津有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12