一种去除核糖体RNA的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体RNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种去除核糖体RNA的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体RNA的方法；该反转录引物池的序列如SEQ ID NO：1～10所示；该试剂盒包含上述反转录引物池，本发明专利技术利用原核生物共有的rRNA序列，设计不同密度覆盖的反转录引物，根据具体需要去除的RNA中本身的rRNA序列的差异，进行特异性的反转录，从而得到与目标RNA完全反向互补的cDNA序列，再通过后续的RNase H和DNase I特异性消化杂合链的rRNA和cDNA，最终去除核糖体RNA；该方法能够搭配建库试剂盒，最终得到浓度足够高的转录组文库，从而有效实现转录组测序在基础研究、临床诊断和药物研发等领域的广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
一种去除核糖体RNA的反转录引物池、试剂盒及去除核糖体RNA的方法
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种去除核糖体RNA构建转录组测序文库的反转录引物池、试剂盒，以及去除核糖体RNA的方法。
技术介绍
随着现代科学技术的发展，生命科学的研究已经进入了组学时代。基因和基因组测序技术已经成为现代生命科学研究，特别是基因组学研究中不可或缺的手段。近年来新一代基因组测序技术突飞猛进的发展带来了基因组学研究的空前繁荣。新一代测序技术已经在生命科学各个领域及农学、医学、环境保护、法医等领域中得到广泛的应用。随着新一代高通量测序技术的快速发展，转录组测序已经成为研究转录组与基因表达的重要手段。转录组是指单个生物物种的个体，或者该个体的特定组织或特定原核生物类型，在特定的环境条件下，或者实验处理条件下所产生的所有转录本的集合。各种类型的转录本都可以通过新一代测序技术进行高通量定量检测，这项技术被称为转录组测序。转录组测序技术可以用作转录本的结构及其变异、基因表达水平、非编码区域功能和低丰度全新转录本发现等各方面的研究上。通过对转录组的研究，人们能够从生物的整体水平上研究基因结构及其基因功能。转录组测序已被广泛应用于遗传学、农学和医学基础研究、医疗诊断和药物研发等领域中。核糖体RNA(rRNA)构成原核生物RNA含量的绝大部分，其占原核生物内RNA含量的约80％-95％。高丰度的rRNA使样本中其他相关的目标分子的分析复杂化，如转录组测序(RNA-seq)分析、微阵列的基因表达分析等；尤其在目标分子含量较少的研究中，rRNA成为巨大的背景污染。因此，通常在构建RNA文库(例如构建转录组文库时)，需要对总RNA进行mRNA(比例约为10％)纯化处理。转录组测序能全面快速地获得某一物种特定组织或器官在特定状态下的几乎所有转录本序列信息，是研究基因表达调控的主要手段。转录组测序中样品是来源于原核生物和组织中经分离的总RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA、LncRNA和小RNA等。对于转录组分析中的目标RNA(mRNA和LncRNA)，rRNA的数据属于冗余信息，在转录组测序中的RNA文库构建中，首先会进行rRNA的去除，再进行常规的RNA建库。现有的用于去除rRNA，进行转录组文库构建的试剂盒，主流的试剂盒使用RNA探针结合链霉亲和素磁珠方法去除rRNA，如Illumina的StrandedTotalRNALT-(withRibo-ZeroTMBacteria)，其试剂盒的探针为外源性合成，价格昂贵，而且只能基于1-2个物种进行设计，其他种属的物种甚至亚种未能保证其去除效率，而且总RNA起始量为100ng-1ug，对于总RNA起始量为1ng-100ng的样品，暂未有能有效去除其rRNA、进行转录组文库构建的试剂盒。这一限制可能导致试剂盒标注物种以外的其他原核物种，或者血浆、血清和Exosome等样品来源的转录组测序文库构建中存在严重的rRNA残留、数据冗余，从而影响后续的mRNA或LncRNA的检出与分析。最后，由于本专利技术使用的方法是特异性的反转录引物结合后，特异性的扩增对应物种的rRNA，并且利用双酶进行酶解消除，因此不受物种间rRNA序列局部差异的影响，原理上能应用于原核源性的其他物种的核糖体去除，实现了不同物种来源的RNA都使用同一套引物进行实验的目的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种构建转录组测序文库前，用于去除核糖体RNA的反转录引物池。本专利技术的第二个目的是提供一种构建转录组测序文库的试剂盒。本专利技术的第三个目的是提供一种构建转录组测序文库时，用于去除核糖体RNA的方法。本专利技术的第四个目的是提供上述方法在构建转录组测序文库中的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的；一种构建转录组测序文库前，用于去除核糖体RNA的反转录引物池，该反转录引物池的序列如SEQIDNO：1～10所示。本专利技术是利用原核生物共有的rRNA序列，设计不同密度覆盖的反转录引物，形成引物池，该引物池有效规避了不同物种甚至亚种之间，核糖体RNA序列有插入和/或缺失片段，带来的与已有探针只能局部反向互补的弊端，能够特异性的生成与样品核糖体RNA完全反向互补的序列，从而实现有效去除核糖体RNA的目的。本专利技术反转录引物池中包括10种引物，在用于去除核糖体RNA时，可以形成不同组合，例如，可以从这10种引物中分别选取3种、4种或者6种引物形成引物组，用于反转录，从而去除核糖体RNA，也可以是将这10种引物形成引物组，用于反转录，从而去除核糖体RNA(具体引物组合实例见表2)。本领域技术人员应能理解，除了上述反转录引物池，在上述反转录引物池的序列上增长或者缩短，位置左移或者右移，或其他不同位置不同长度的组合均在本专利技术的保护范围内。进一步地，含有上述去除核糖体RNA的反转录引物池的，用于构建转录组测序文库的试剂盒也在本专利技术的保护范围内。该在本专利技术保护范围内的试剂盒，加入的外源性核酸数量少(本专利技术的试剂盒没有探针等外源性核酸)，引物池除了具备上述的优点外，还能契合不同物种(甚至亚种样品来源的RNA样品)，因此拓宽了本专利技术试剂盒的应用范围，为更多的原核物种，甚至是指定位置的基因组序列的物种转录组文库中，缺乏对应的去除核糖体RNA的试剂盒，弥补了空白，实现了原核物种的转录组研究缺乏有效试剂的问题。优选地，上述试剂盒还含有RNaseH、DNaseI；这里RNaseH、DNaseI分别用于特异性消除通过反转录引物池，以样品总RNA为模板获得的与目标RNA完全反向互补的cDNA序列(cDNA-rRNA杂合链)中rRNA和cDNA。更优选地，试剂盒中RNaseH的用量为3U～6U，DNaseI的用量为2.5U～10U，此时rRNA的去除效率较高。优选地，上述试剂盒中，反转录引物池中每条引物的浓度范围为5μM～100μM，此时rRNA的去除效率较高。更优选地，反转录引物池中每条引物的浓度范围为10μM时，rRNA的去除效果最好。优选地，试剂盒中，反转录引物池中每条引物的浓度均相同，从而保证每条引物等同的反转录效率。一种构建转录组测序文库前，用于去除核糖体RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)针对目的rRNA设计得到反转录的引物池；(2)提取样品的总RNA，加入引物池进行反转录，得cDNA-rRNA杂合链；(3)加入RNaseH消除cDNA-rRNA杂合链的rRNA，再加入DNaseI消除cDNA-rRNA杂合链的cDNA；(4)回收剩余的RNA产物。这里，步骤(2)、(3)所述cDNA-rRNA杂合链为经过反转录得到的rRNA的cDNA和rRNA结合的杂合链。这里，步骤(4)剩余的RNA产物包括去除rRNA后的mRNA和lncRNA等其他RNA。在本专利技术中，利用原核生物共有的rRNA序列，设计不同密度覆盖的反转录引物，根据具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建转录组测序文库前，用于去除核糖体RNA的反转录引物池，其特征在于，该反转录引物池的序列如SEQ ID NO：1～10所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建转录组测序文库前，用于去除核糖体RNA的反转录引物池，其特征在于，该反转录引物池的序列如SEQIDNO：1～10所示。


2.一种构建转录组测序文库的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的去除核糖体RNA的反转录引物池。


3.根据权利要求2所述的构建转录组测序文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有RNaseH、DNaseI。


4.根据权利要求3所述的构建转录组测序文库的试剂盒，其特征在于，所述反转录引物池中每条引物的浓度范围为5μM～100μM。


5.一种构建转录组测序文库时，用于去除核糖体RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对目的rRNA设计得到反转录的引物池；
(2)提取样品的总RNA，加入引物池进行反转录，得cDNA-rRNA杂合链；
(3)加入RNaseH消除cDNA-rRNA杂合链的rRNA，再加入DNaseI消除cDNA-r...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹亮，吴胜标，喻志红，蒋华，束文圣，
申请(专利权)人：广东美格基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44