利用超声波减少小白链霉菌发酵过程菌丝体爬壁的方法技术

本发明专利技术公开了利用超声波减少小白链霉菌发酵过程菌丝体爬壁的方法，涉及发酵工程技术领域。采用低强度超声处理培养至对数中期的小白链霉菌，发酵过程中菌丝体结块絮凝现象显著减缓，爬壁菌丝体量由18～29％减少至5.8～11％。利用本发明专利技术公开的超声波辅助发酵生产ε‑聚赖氨酸的工艺，可提高细胞新陈代功能，能够有效改善ε‑聚赖氨酸发酵过程中菌丝体爬壁问题。因此该工艺有着巨大的经济效益和社会效益，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
利用超声波减少小白链霉菌发酵过程菌丝体爬壁的方法
本专利技术涉及发酵工程
，具体涉及利用超声波减少小白链霉菌发酵过程菌丝体爬壁的方法。
技术介绍
ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种天然的抗菌聚阳离子肽，由25至35个L-赖氨酸(Lys)残基组成，在ε-氨基和α-羧基之间具有连接键。天然产物ε-PL是食品级抗菌剂，对腐败生物和食品病原体非常有效。ε-聚赖氨酸和ε-聚赖氨酸盐酸盐(ε-聚赖氨酸的衍生物)，由于其水溶性，可生物降解，可食用且无毒，在过去的几十年中在日本，美国，韩国和中国被广泛用于工业应用中。小白链霉菌(Streptomycesalbulus)可用于发酵生产ε-聚赖氨酸。但随着发酵的进行，小白链霉菌的菌丝结团很严重，在发酵过程的稳定期，大量的菌丝吸附于发酵罐罐壁且菌丝悬于发酵液上方，形成菌丝体“爬壁”现象，难以与发酵液相接触，并造成发酵液体积逐渐减少，严重制约着ε-聚赖氨酸的发酵生产效率。超声技术作为一种新型的非热物理处理技术，已广泛用于食品工业，尤其是用于微生物发酵工程。低强度超声波依靠机械振动和稳态空化效应使传质边界层减薄，并且使溶质粒子运动加速，这对于反应物进入酶或细胞活性部位及产物进入液体介质扩散作用有利，可提高生物反应速度。在超声波作用下，声空化效应中空化气泡的生成和破裂会给周围的液体介质带来机械效应和空化效应。在超声波强化发酵过程中，超声波的冲击破坏了细胞团簇，增加了团块的孔隙率，同时增强了细菌细胞间的传质，加速了细胞对底物的吸收。因此，超声波的机械振动和空化效应等作用有望打破发酵进程中菌丝结团的问题，有效克服发酵罐中菌丝体爬壁现象。但目前为止，尚未有关于用超声波减少小白链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸过程中菌丝体爬壁现象的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用超声波减少小白链霉菌发酵过程菌丝体爬壁的方法，以避免发酵后期大量的菌丝吸附于发酵罐罐壁或悬于发酵液上方，难以与发酵液相接触，以致降低ε-聚赖氨酸产量。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：以小白链霉菌作为生产菌株，将其接种于种子培养基进行菌种活化并培养至对数期，将活化后的菌液接种于发酵罐中进行扩大培养。将发酵液在一定条件下进行适度的低强度超声波处理，再将处理后的发酵液在适宜条件下继续培养，利用小白链霉菌批次发酵生产ε-聚赖氨酸。上述利用超声波减少小白链霉菌发酵过程菌丝体爬壁的方法，按照下述步骤进行：(1)小白链霉菌菌丝体培养条件菌种保存方法：将小白链霉菌(Streptomycesalbulus，CICC11022)接种于贝特纳固体培养基(BTN培养基)上，30℃恒温静置培养7d，置于4℃冰箱中备用；种子液培养方法：用接种环挑取固体培养基上活化后的S.albulus，接入种子液培养基(M3G种子培养基)中，于30℃、180r/min条件下恒温培养24h；液态发酵培养：配制1.5L发酵培养基装入到发酵罐中，发酵初始pH调为6.8。灭菌完成后，将种子培养液(种龄：对数期24h)以8％的接种量接入并进行发酵。发酵之前先将发酵温度控制在30℃，通风条件设为5.0L/min，转速200r/min，罐压维持在0.05MPa，整个过程溶氧(DO)100％后自然下降。当发酵pH从初始6.8自然降低到4.0以下时，添加12.5％(v·v-1)的NH3·H2O来维持pH至4.0。(2)超声辅助发酵条件将活化后的小白链霉菌菌液接种于种子培养基，在接种后的第26～42小时用狭缝式超声波装置在一定条件下进行适度的处理促进其菌丝体分散和产物ε-聚赖氨酸增加。超声波处理条件为温度30℃，采用单一频率超声(频率为20、28或60kHz)进行处理，超声波功率密度100～300W/L，处理时长为1～16h，外接循环泵设置发酵液流速为50～100mL/min。进一步地，所述液态发酵培养中的发酵培养基为(g/L)：葡萄糖-甘油(1:1，w·w-1)60g，牛肉浸膏10g，(NH4)2SO410g，KH2PO44g，MgSO4·7H2O0.8g，FeSO4·7H2O0.05g，有机硅消泡剂1.5g，pH6.8。通过对比试验(发酵液是否施加超声，其他条件相同)，经检测，本专利技术采用低强度超声的小白链霉菌S.albulus，在同等条件下与无超声处理相比，显著减缓了小白链霉菌菌丝体的爬壁问题，发酵48h时附着在发酵罐爬壁的菌丝体数量由18～29％减少到5.8～11％，保证了后续发酵的正常进行。与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：(1)避免了发酵后期菌丝体大量附着于发酵罐壁。传统的发酵罐在正常发酵情况下会出现菌丝体爬壁问题，造成实际参与合成ε-聚赖氨酸过程的菌体减少，发酵液流失，这对于ε-聚赖氨酸的工业生产是极为不利的。利用本专利技术所述的工艺，发酵罐罐壁菌丝体附着量大幅减少，显著提高了ε-聚赖氨酸的产量。(2)可为解决其他发酵过程类似问题提供参考。在发酵过程进行超声波辅助处理可保证参与发酵的菌丝体数量，提高发酵生产效率，为其他的发酵过程解决类似的爬壁问题提供了一条解决途径。附图说明附图1是本专利技术使用的单频狭缝式超声发酵处理装置的示意图。其中：1.狭缝式超声波设备2.控制面板3.超声发生器4.超声波换能器5.料液入口6.料液出口7.灭菌通气口8.蠕动泵9.发酵罐10.DO电极11.pH电极12.空气流量13.温度传感器14.空气过滤器15.排气口16.循环冷凝水17.电动泵18.发酵罐主控制台19.电脑主机具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。实施例所描述的具体的工艺条件及其结果仅用于说明本专利技术而不限于本专利技术范围。这种利用上述发酵生产ε-聚赖氨酸过程中消减菌丝体爬壁的方法工艺实施需要将狭缝式超声设备1，外接蠕动泵8及发酵罐9等组合使用，狭缝式超声设备1通过硅胶软管外接于发酵罐体9。该狭缝式超声设备在使用前需经蒸汽灭菌，控制压力表显示0.12Mpa左右，灭菌15min，蒸汽灭菌期间需微开灭菌通气口7。发酵罐、补料瓶及连接软管则使用灭菌锅同步灭菌，灭菌时保证除排气口15外其余通道用止水夹封死。灭菌结束后，在酒精灯火焰下，将图中狭缝式超声设备与发酵罐通过软管连接(接口5和6)。等罐体冷却，可借助发酵罐主控制台18上的电动泵17进行接种操作以避免染菌，并通过控制台中设定空气流量大小(12)，且导入罐内的空气必须经过已灭菌的空气过滤器14以免染菌。超声处理时通过控制面板2设定超声处理时间及频率，通过超声发生器3的按钮调节超声功率，换能器4(①～⑥)的目的是将超声波发生器产生的超音频电能转换成高频机械振荡而传入反应液体中，从而起到加速反应的作用。罐内发酵液通过外接蠕动泵8将其导入超声设备反应室3(保证充满整个超声反应腔)，经超声处理的发酵液循环流入发酵罐中，实现发酵液的循环式超声刺激，并通过外接蠕动泵8控制发酵液流速。整个过程温度设定30℃不变，超声处理过程中可利用循环冷凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用超声波减少小白链霉菌发酵过程菌丝体爬壁的方法，其特征在于按照下述步骤进行：/n(1)小白链霉菌菌丝体培养条件/n菌种保存方法：将小白链霉菌(Streptomyces albulus，CICC 11022)接种于贝特纳固体培养基(BTN培养基)上，30℃恒温静置培养7d，置于4℃冰箱中备用；/n种子液培养方法：用接种环挑取固体培养基上活化后的S.albulus，接入种子液培养基(M3G种子培养基)中，于30℃、180r/min条件下恒温培养24h；/n液态发酵培养：配制1.5L发酵培养基装入到发酵罐中，发酵初始pH调为6.8；灭菌完成后，将种子培养液(种龄：对数期24h)以8％的接种量接入并进行发酵；发酵之前先将发酵温度控制在30℃，通风条件设为5.0L/min，转速200r/min，罐压维持在0.05MPa，整个过程溶氧(DO)100％后自然下降；当发酵pH从初始6.8自然降低到4.0以下时，添加12.5％(v·v

【技术特征摘要】
1.利用超声波减少小白链霉菌发酵过程菌丝体爬壁的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
(1)小白链霉菌菌丝体培养条件
菌种保存方法：将小白链霉菌(Streptomycesalbulus，CICC11022)接种于贝特纳固体培养基(BTN培养基)上，30℃恒温静置培养7d，置于4℃冰箱中备用；
种子液培养方法：用接种环挑取固体培养基上活化后的S.albulus，接入种子液培养基(M3G种子培养基)中，于30℃、180r/min条件下恒温培养24h；
液态发酵培养：配制1.5L发酵培养基装入到发酵罐中，发酵初始pH调为6.8；灭菌完成后，将种子培养液(种龄：对数期24h)以8％的接种量接入并进行发酵；发酵之前先将发酵温度控制在30℃，通风条件设为5.0L/min，转速200r/min，罐压维持在0.05MPa，整个过程溶氧(DO)100％后自然下降；当发酵pH从初始6.8自然降低到4.0以下时，添加12.5％(v·v-1)的NH3·H2O来维...

【专利技术属性】
技术研发人员：何荣海，向珈慧，马海乐，任晓锋，代春华，孙玲，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32