一种心肌肌钙蛋白T检测试剂盒及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种心肌肌钙蛋白T检测试剂盒及其制备方法和用途。本发明专利技术所述试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，所述第一株抗体和第二株抗体为抗心肌肌钙蛋白T的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的心肌肌钙蛋白T特异性结合位点不同。使用本发明专利技术提供的试剂盒能够以极高的灵敏度检测样本的cTnT浓度，约10分钟即可得到检测结果，可以实现快速、灵敏、定量检测样本的cTnT的浓度，能够用于尽早准确的诊断出急性心肌梗死(AMI)、不稳定心绞痛、术后心肌损伤及与心肌肌肉损伤。

【技术实现步骤摘要】
一种心肌肌钙蛋白T检测试剂盒及其制备方法和用途
本专利技术涉及生化检测领域，具体涉及一种心肌肌钙蛋白T检测试剂盒及其制备方法和用途。
技术介绍
肌钙蛋白复合物由肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白C(TnC)和肌钙蛋白T(TnT)三个亚基组成，它在骨骼肌和心肌收缩过程中起到重要的调节作用。其中，TnT是原肌球蛋白结合亚基，可调节肌钙蛋白复合物与细肌丝之间的相互作用。人骨骼肌中的TnT(skTnT)亚型有两种，心肌中的TnT有多种亚型，而且心肌中的亚型与骨骼肌中的亚型是不同的。心肌肌钙蛋白T(cTnT)可以作为心肌细胞死亡的标记物，已被广泛但应用于急性心肌梗死(AMI)、不稳定心绞痛、术后心肌损伤及与心肌肌肉损伤有关的疾病的诊断。一般在胸痛发作后3-6小时内，可在患者血液中检测到cTnT，同时该检测值会在16-30小时内达到峰值。有研究表明，血液中cTnT浓度的升高的现象，甚至可以持续到症状出现后的5-8天，这说明cTnT对于急性心肌梗死的后期诊断具有一定的参考价值。同时，心肌肌钙蛋白在心肌受损时具有释放迅速、峰值明显、组织特异性强、窗口诊断期长等优点，被作为诊断急性心肌梗死的金标准，同时，心肌肌钙蛋白也被称为新机疾病病情监测、疗效观察、危险分级和预后评估的最适标志物。目前，肌钙蛋白的免疫检测方法有多种，其中包括放射性同位素免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析法(ICA)以及近年来逐渐被广泛适用的化学发光法(CLIA)等。放射性同位素免疫分析法(RIA)的检测原理，将同位素标记的抗原与待测的未标记的抗原分别与不足量的特异性抗体竞争性的结合反应后，通过测量反应的放射性，获得待测抗原的量。该法是80年代以来被日益广泛应用的超微量分析技术。酶联免疫吸附法(ELISA)检测原理，以双抗体夹心法为例，是在固相载体上包被一种特异性抗体，加入待测样本后，再加入酶标记的另一种抗体，形成双抗体夹心复合物，再通过发光底物的显色作用，使仪器可以定量检测出的免疫反应。胶体金免疫层析法作为POCT检验的一种方法，具有上样量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。其原理如下，仍以双抗体夹心法为例，当含有抗原的样本滴加到吸收孔后，抗原先与胶体金标记的抗体结合形成抗原-抗体复合物，然后固定在样品垫上的另一种抗原会捕获该复合物，形成双抗体夹心复合物，并产生一个色带，而被检测到的免疫检测法。化学发光法作为近年来逐渐兴起的一种免疫检测技术，是将免疫反应系统和化学发光技术紧密结合的产物。其中化学发光技术是利用发光物质，如吖啶酯等，经氧化剂氧化和催化剂催化后，形成一个激发态的中间体，再利用相应的测量仪器测量该中间体在回到基态时产生的光量子产额的检测手段。而免疫反应系统是将发光标记物质标记在抗原或抗体上，再通过形成抗原-抗体复合物进行检测。该技术具有特异性强、灵敏度高、精密度好、线性范围宽、高通量和易于实现自动化的优点。放射性同位素免疫分析法(RIA)具有操作繁琐、耗时长、结果重复性差和核污染等问题，不适用于大批量检测，现已基本不使用。酶联免疫吸附法(ELISA)，则存在着操作繁琐、灵敏度低、线性范围窄和检测周期长等缺点。而早期AMI发作时，其血清中肌钙蛋白的含量往往很低，由于灵敏度低和检测周期长，该法无法快速准确的检测出早期AMI，这也进一步限制了ELISA在心肌检测中的使用。胶体金免疫层析法作为POCT检验的一种方法，具有上样量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。但由于该法的灵敏度差，进一步限制了其在肌钙蛋白临床检测上的应用。目前，市面上常见的检测肌钙蛋白的化学发光法试剂盒，多用于检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)，其中很多试剂盒存在着灵敏度不足、精密度不高、检测时间过长等缺点，无法满足AMI早期诊断的要求，基本无法在表面健康人群中检测出来，在缺血症状或心电图改变不典型时，这有可能导致延迟诊断甚至误诊，不利于早期诊断、风险评估和预后判断。而且cTnI有多种形式，这导致肌钙蛋白I检测标准不统一，不同系统的cTnI结果不同。相对而言，cTnT的形式单一，且有文献报道cTnT在晚期检测、愈后检测方面和预报愈后死亡率的预报方面的准确性优于cTnI。可见，cTnT检测临床意义重要。CN101226200A公开了用化学发光免疫分析检测人cTnT的方法，其使用吖啶酯和/或碱性磷酸酶作为标记物，免疫反应采用双单抗夹心法和/或竞争法。但该文献在检测样本时，所使用的孵育条件为37℃，60分钟，存在检测时间过长的问题，不能满足AMI早期诊断的高要求。而且该文献仅提及灵敏度即空白限(LoB)，但它并不是临床可报告值，当不精密度CV>20％时，结果会变得不可靠。而目前美国的大多数临床机构使用定量限(LoQ)进行报告，定量限(LoQ)为CV最接近20％的最低浓度，该值的检测对于试剂盒的性能测试具有重要的意义。
技术实现思路
专利技术要解决的问题针对以上现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种超敏心肌肌钙蛋白T检测试剂盒，该试剂盒具有更优的灵敏度和特异性，能够快速的得到检测结果，有效区分正常人与早期AMI患者，有助于快速诊断心肌梗死和微小型心肌损伤患者。本专利技术的另一目的在于提供心肌肌钙蛋白T检测试剂盒的制备方法。此外，本专利技术还提供了上述试剂盒的用途。用于解决问题的方案在一个技术方案中，本专利技术提供了一种心肌肌钙蛋白T检测试剂盒，所述试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，所述第一株抗体和第二株抗体为抗心肌肌钙蛋白T的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的心肌肌钙蛋白T特异性结合位点不同。在一个实施方式中，所述第一株抗体所识别的心肌肌钙蛋白T的氨基酸位点为171-190，所述第二株抗体所识别的心肌肌钙蛋白T的氨基酸位点为132-152。在另一个实施方式中，所述磁性微球选自纳米级Fe2O3和/或Fe3O4的磁性微粒与高分子材料的复合体。在另一个实施方式中，所述磁性微球的平均粒径为1-5μm。在另一个实施方式中，所述磁性微球表面有多个活性基团，优选地，活性基团为-OH和/或-COOH。在另一个实施方式中，所述示踪标记物选自吖啶酯、鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和金刚烷中的一种，优选的，所述示踪标记物为吖啶酯。在另一个实施方式中，所述第一株抗体和所述第二株抗体浓度为1-18μg/ml，所述磁性微球的浓度为0.1-1mg/ml，所述示踪标记物的浓度为0.1-1μg/ml。在另一个实施方式中，所述磁性微球与所述第一株抗体的质量比为100:1-2；进一步优选质量比为100:1.5。在另一个实施方式中，所述示踪标记物与所述第二株抗体的摩尔比为14-18:1；进一步优选摩尔比为15:1。在另一个实施方式中，所述试剂盒包括校准品、磁性微球清洗液和化学发光激发液。在另一个实施方式中，所述试剂盒包括液态校准品，优选地，所述液态校准品包括含有心肌肌钙蛋白T抗原的PBS缓冲液，进一步优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种心肌肌钙蛋白T检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，所述第一株抗体和第二株抗体为抗心肌肌钙蛋白T的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的心肌肌钙蛋白T特异性结合位点不同。/n

【技术特征摘要】
1.一种心肌肌钙蛋白T检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被于磁性微球的第一株抗体和标记有示踪标记物的第二株抗体，所述第一株抗体和第二株抗体为抗心肌肌钙蛋白T的单克隆抗体且第一株抗体和第二株抗体所识别的心肌肌钙蛋白T特异性结合位点不同。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一株抗体所识别的心肌肌钙蛋白T的氨基酸位点的序列为如SEQIDNO:1所示的序列，所述第二株抗体所识别的心肌肌钙蛋白T的氨基酸位点的序列为如SEQIDNO:3所示的序列。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球选自纳米级Fe2O3和/或Fe3O4的磁性微粒与高分子材料的复合体，所述磁性微球的平均粒径为1-5μm；所述示踪标记物选自吖啶酯、鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和金刚烷中的一种；优选的，所述示踪标记物为吖啶酯。


4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述示踪标记物与第二株抗体的摩尔比为14-18:1和/或所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:1-2。


5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王萧慧，张瑞，石晓强，徐建新，李福刚，
申请(专利权)人：上海奥普生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31