基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于双衍生化技术的脂肪酸LC‑MS/MS分析方法，包括以下步骤：一、制备脂肪酸混合标准品溶液；二、制备2‑肼基嘧啶衍生化溶液；三、制备衍生化内标溶液；四、制备2‑肼基‑4,6‑二甲基嘧啶衍生化溶液；五、制备各标准曲线待测溶液；六、采用LC‑MS/MS法检测各标准曲线待测溶液，建立各种脂肪酸的标准曲线；七、取待测样品，加入DMP衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，再加入衍生化内标溶液，混匀，离心后取上清液，采用LC‑MS/MS法测量，得到脂肪酸的种类和含量。本发明专利技术能有效提升脂肪酸的质谱检测灵敏度和特异性，并可以实现短链、中链、长链和超长链脂肪酸的同时定量分析。

【技术实现步骤摘要】
基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法
本专利技术涉及分析检测
更具体地说，本专利技术涉及一种基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法。
技术介绍
脂肪酸(Fattyacid,FA)是一类具有脂肪链的羧酸类化合物。根据脂肪族链的长度，脂肪酸可分为：短链脂肪酸(SCFAs，≤6碳原子)、中链脂肪酸(MCFAs，7-12碳原子)、长链脂肪酸(LCFAs，13-21碳原子)和超长链脂肪酸(VLCFAs，≥22碳原子)。根据是否含碳碳双键分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。脂肪酸在生物体内起着多种关键作用：(1)脂肪酸是构成生物膜的各种功能脂质分子的重要组成部分；(2)脂肪酸可以β-氧化供能，是机体最重要的能量供应物质之一；(3)脂肪酸参与分子信号传导并调节其进程；(4)脂肪酸与肿瘤，糖尿病、心脏病、代谢综合征和药物性肝损伤(DILI)等疾病密切相关。所以对脂肪酸进行有效综合分析对相关疾病发病机制的阐明和临床诊疗具有重大意义。衍生化技术是指待测化合物的特定基团与衍生化试剂进行快速反应，定量生成衍生化物，然后通过检测衍生化物的量来间接测定待测化合物的量。目前液相色谱质谱联用技术(LC-MS)是脂肪酸分析的主流方法。然而，由于脂肪酸的化学结构特点，其在电喷雾离子源中的离子化效率较差，使得其质谱检测灵敏度较差。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法，其通过双衍生化技术改变脂肪酸的物理化学特征，从而改善其色谱行为，增强质谱检测过程中的离子化效率，提升脂肪酸的质谱检测灵敏度。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法，其包括以下步骤：步骤一、以乙腈为溶剂，加入含等质量脂肪酸的多种脂肪酸标准品，制备脂肪酸混合标准品溶液；步骤二、以乙腈为溶剂，依次加入2-肼基嘧啶、酰胺反应缩合剂，混合均匀，得到2-肼基嘧啶衍生化溶液；步骤三、取部分脂肪酸混合标准品溶液，加入2-肼基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，得衍生化内标溶液；步骤四、以乙腈为溶剂，依次加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶、酰胺反应缩合剂，混合均匀，得到2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液；步骤五、将剩余部分的脂肪酸混合标准品溶液等分并用乙腈稀释成多种浓度的脂肪酸混合标准品稀释液，分别加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，然后分别加入衍生化内标溶液，得各标准曲线待测溶液；步骤六、采用LC-MS/MS法检测各标准曲线待测溶液，建立各种脂肪酸的标准曲线；其中，液相色谱条件为：色谱柱：沃特世BEHC18(100mm×2.1mm,1.7μm)；流速：0.5mL/min；柱温：55℃；进样量：1μL；流动相：A为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B为体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：0-3min，10-20％B；3-3.01min，20-70％B；3.01-7min，70-100％B；7-9min，100-100％B；9-9.01min，100-10％B；9.01-10min，10％B；分析时间：10min；质谱条件为：使用正离子扫描，多反应监测的数据采集模式，电喷雾离子源参数为：喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：30psi；步骤七、取待测样品，加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，再加入衍生化内标溶液，混匀，离心后取上清液，采用LC-MS/MS法测量，得到脂肪酸的种类和含量。优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法中，步骤七中的待测样品及步骤五中参与衍生化反应的各浓度的脂肪酸混合标准品稀释液的体积均相同，且步骤七中加入的2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液、衍生化内标溶液的体积均与在步骤五中各浓度的脂肪酸混合标准品稀释液中的加入量相同。优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法中，所述待测样品溶液为血浆。优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法中，所述酰胺反应缩合剂为1-乙基-3-[3-二甲基氨基-丙基]碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑水合物、2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基尿鎓六氟磷酸酯和乙基二异丙胺中的任意两种。优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法中，所述酰胺反应缩合剂为2-(7-氮杂苯并三氮)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和乙基二异丙胺。优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法中，所述酰胺反应缩合剂中各物质的质量比为1/5～5。优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法中，所述脂肪酸混合标准品溶液与所述2-肼基嘧啶衍生化溶液、所述脂肪酸混合标准品稀释液与所述2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液、所述待测样品与所述2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液反应时间均小于60min，反应温度均为10～60℃。优选的是，所述的基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法中，所述脂肪酸混合标准品溶液与所述2-肼基嘧啶衍生化溶液、所述脂肪酸混合标准品稀释液与所述2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液、所述待测样品与所述2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液旋涡混合反应时间均为60s，反应温度均为室温。本专利技术中的2-肼基-4,6-二甲基嘧啶可简写为DMP，2-肼基嘧啶可简写为DP，1-乙基-3-[3-二甲基氨基-丙基]碳二亚胺盐酸盐可简写为EDC，1-羟基苯并三唑水合物可简写为HOBT，2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基尿鎓六氟磷酸酯可简写为HATU，乙基二异丙胺可简写为DIEA，脂肪酸简写为FA，碰撞诱导解离简写为CID，电喷雾离子源简写为ESI，检测限简写为LOD，衍生化内标简写为TDIS，相对标准偏差简写为RSD，多反应监测简写为MRM，微型离心管简写为EP管，室温简写为RT。本专利技术的工作原理为：具有相似结构的同系物DMP和DP，作为衍生化试剂，在缩合剂HATU和DIEA的作用下，均可同脂肪酸发生反应，脂肪酸的羧基和DMP或DP的肼基可以迅速结合，脂肪酸的羧基被转化成酰胺键，同时由于DMP或DP结构中存在的多个氮原子，使得DMP或DP修饰后的脂肪酸在电喷雾离子源的离子化效率增加，从而显著提升了其质谱检测灵敏度，DMP和DP的衍生化机制分别如图1(A)和图1(B)所示，通过对脂肪酸衍生物的质谱分析间接对脂肪酸进行定量分析。被衍生化的脂肪酸可以在相同的碰撞能量下产生一致的最强离子，对于被DMP衍生化的脂肪酸可以产生m/z139的最强子离子，对于被DP衍生化的脂肪酸则是得到m/z111的最强子离子。脂肪酸经过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一、以乙腈为溶剂，加入含等质量脂肪酸的多种脂肪酸标准品，制备脂肪酸混合标准品溶液；/n步骤二、以乙腈为溶剂，依次加入2-肼基嘧啶、酰胺反应缩合剂，混合均匀，得到2-肼基嘧啶衍生化溶液；/n步骤三、取部分脂肪酸混合标准品溶液，加入2-肼基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，得衍生化内标溶液；/n步骤四、以乙腈为溶剂，依次加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶、酰胺反应缩合剂，混合均匀，得到2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液；/n步骤五、将剩余部分的脂肪酸混合标准品溶液等分并用乙腈稀释成多种浓度的脂肪酸混合标准品稀释液，分别加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，然后分别加入衍生化内标溶液，得各标准曲线待测溶液；/n步骤六、采用LC-MS/MS法检测各标准曲线待测溶液，建立各种脂肪酸的标准曲线；/n其中，液相色谱条件为：色谱柱：沃特世BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm)；流速：0.5mL/min；柱温：55℃；进样量：1μL；流动相：A为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B为体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：0-3min，10-20％B；3-3.01min，20-70％B；3.01-7min，70-100％B；7-9min，100-100％B；9-9.01min，100-10％B；9.01-10min，10％B；分析时间：10min；/n质谱条件为：使用正离子扫描，多反应监测的数据采集模式，电喷雾离子源参数为：喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：30psi；/n步骤七、取待测样品，加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，再加入衍生化内标溶液，混匀，离心后取上清液，采用LC-MS/MS法测量，得到脂肪酸的种类和含量。/n...

【技术特征摘要】
1.基于双衍生化技术的脂肪酸LC-MS/MS分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、以乙腈为溶剂，加入含等质量脂肪酸的多种脂肪酸标准品，制备脂肪酸混合标准品溶液；
步骤二、以乙腈为溶剂，依次加入2-肼基嘧啶、酰胺反应缩合剂，混合均匀，得到2-肼基嘧啶衍生化溶液；
步骤三、取部分脂肪酸混合标准品溶液，加入2-肼基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，得衍生化内标溶液；
步骤四、以乙腈为溶剂，依次加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶、酰胺反应缩合剂，混合均匀，得到2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液；
步骤五、将剩余部分的脂肪酸混合标准品溶液等分并用乙腈稀释成多种浓度的脂肪酸混合标准品稀释液，分别加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，然后分别加入衍生化内标溶液，得各标准曲线待测溶液；
步骤六、采用LC-MS/MS法检测各标准曲线待测溶液，建立各种脂肪酸的标准曲线；
其中，液相色谱条件为：色谱柱：沃特世BEHC18(100mm×2.1mm,1.7μm)；流速：0.5mL/min；柱温：55℃；进样量：1μL；流动相：A为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B为体积分数为0.1％的甲酸乙腈溶液；洗脱梯度：0-3min，10-20％B；3-3.01min，20-70％B；3.01-7min，70-100％B；7-9min，100-100％B；9-9.01min，100-10％B；9.01-10min，10％B；分析时间：10min；
质谱条件为：使用正离子扫描，多反应监测的数据采集模式，电喷雾离子源参数为：喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃；雾化气流速：60psi；辅助加热气流速：60psi；气帘气流速：30psi；
步骤七、取待测样品，加入2-肼基-4,6-二甲基嘧啶衍生化溶液混匀至脂肪酸均被衍生化，再加入衍生化内标溶液，混匀，离心后取上清液，采用LC-MS/MS法测量，得到脂肪酸的种类和含量。


2.如权利要求1所述的基于双衍生...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽宏，胡婷，李晗，安卓玲，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京朝阳医院，
类型：发明
国别省市：北京;11