一种检测Wx1分子标记及应用于甜糯玉米选育的方法技术

本发明专利技术属于植物生物技术领域，具体涉及一种快速选育鲜食玉米中

【技术实现步骤摘要】
一种检测Wx1分子标记及应用于甜糯玉米选育的方法
本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种选育鲜食玉米自交系调控Wx1糯质基因的特异性分子标记的开发和利用所述分子标记快速选育优良鲜食甜糯玉米自交系的方法。
技术介绍
随着人们对鲜食玉米的喜爱和消费需求日益增强，鲜食玉米种植面积逐年扩增。市场对鲜食玉米的需求，不仅仅停留在鲜食玉米的商品外观性、贮运能力上，更是对优质口感提出了更高的要求。甜糯玉米是近年来我国最具发展潜力的新型鲜食玉米，由于糯中带甜，甜度适中的独特口感，广受消费者的喜爱，2018年种植面积已超过200万亩，这引起了育种家们对鲜食甜糯玉米自交系选育的重视。在玉米(ZeamaysL.)中，已经有不同淀粉突变体的相关研究，并在其功能上取得了重大进展，比如Ae1[1]、Su1[2]、和Waxy1(Wx1)[3,4]。其中，Wx1基因编码颗粒结合型淀粉合成酶，在拟南芥和谷物已有相关应用研究。若Wx1基因缺失，胚乳中直链淀粉含量将急剧降低，从而形成具有糯性的糯玉米子粒。而甜糯玉米的子粒，由于甜质相关基因位于淀粉合成途径上游，在甜质基因隐性纯合时，直链淀粉合成受阻，从而使糖度含量升高，而淀粉含量降低，此时的子粒即使Wx1为隐性纯合也无法判定出糯性性状[5]。通常情况下，育种家们可以利用多个材料进行杂交测配，再从多代群体中反复观察甜子粒和糯性子粒分离比是否符合孟德尔定律，再推断该材料是否为甜糯玉米自交系，采用这种方式选育甜糯玉米，不仅耗时、费力、效率低，同时容易产生基因连锁累赘而影响甜糯玉米本身的口感，很难选育新的甜糯玉米品种。因此，建立科学、实用、便捷的鲜食甜糯玉米的鉴别方法对于快速选育甜糯玉米具有十分重要的应用价值。至今为止，对鲜食甜糯玉米基因的鉴定，主要采用聚合酶链式反应(PCR)产物测序分析、限制性片段长度多态性扩增(RFLP)、简单重复序列(SSR)等方法。但PCR方法存在对基因灵敏度低的缺点，容易受到假阳性的影响，检测结果存在不确定性，而RFLP、SSR方法实验操作繁琐，实验过程较为费时、费工，不适于大规模的鲜食玉米育种。因此，开发一种简便实用、低成本、高通量的分子标记方法克服现有技术的不足，具有重要意义。高分辨率熔解曲线分析(High-ResolutionMeltingCurveAnalysis，HRM)是一种针对单核苷酸多态性、突变研究及鉴定的工具，具有操作简单、快速、成本低、鉴定结果准确等特性。在植物分子育种中，可对突变扫描、基因分型、基于特定基因的种质资源鉴定以及功能标记开发等方面实现理想的应用价值。根据Wx1的序列，结合HRM方法，开发与Wx1基因的分子标记，并建立中高通量辅助选育体系，能够大大提高鲜食玉米自交系选育的效率。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用分子标记快速、准确检测鲜食玉米糯质基因Wx1的方法，并提供一种结合高分辨率熔解曲线分析(High-ResolutionMeltingCurveAnalysis,HRM)用于检测鲜食玉米糯质基因Wx1的分子标记引物，所述引物根据Wx1基因序列的基因特异性单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)设计，可以结合HRM用于Wx1基因的辅助选择，并利用所开发的分子标记快速选育甜糯双隐性基因的鲜食玉米自交系，用于提高鲜食玉米的选育效率，进而推进鲜食玉米的育种进程和生产应用以满足日益增长的市场需求。本专利技术提供如下解决方案：一种结合HRM用于检测鲜食玉米糯质基因Wx1的分子标记引物，其上、下游序列分别为：Wx1-HRM-1F：5’-CAGGCTGGAAGAGCAGAAGG-3’(SEQIDNO：4)；Wx1-HRM-1R：5’-CACACGTACCAGCAGAACGAT-3’(SEQIDNO：5)；上述引物根据Wx1基因序列的基因特异性SNP设计，其基因特异性SNP分别位于Wx1基因(SEQIDNO：1)的第495、1370、1453和1472位单核苷酸碱基。一种结合HRM检测鲜食甜糯玉米糯质基因Wx1的方法：a)提取待测样本DNA；b)用检测引物对(SEQIDNO：4和5)进行PCR扩增；c)对PCR产物进行HRM分析扫描。一种鲜食甜糯玉米自交系材料分子标记辅助选育方法：以甜糯玉米材料为亲本，与其他甜质玉米品种杂交，提取后代甜质子粒个体基因组DNA，分别以引物对Wx1-HRM-1F、Wx1-HRM-1R(SEQIDNO：4和5)进行PCR扩增，留取其扩增产物的高分辨率熔解曲线与玉米材料“S1”的熔解曲线相同的植株，进行套袋自交获得F2。以引物对Wx1-HRM-1F、Wx1-HRM-1R(SEQIDNO：4和5)再次进行PCR扩增与阳性对照玉米材料“N1”的熔解曲线一致，同时与玉米材料“T1、S1”的熔解曲线不同，即为甜糯双隐性玉米自交系材料，后续通过田间筛选并进行自交繁殖，获得优良农艺性状的自交系。其中材料T1为华南师范大学生命科学院提供的华旺甜7号DNA，材料N1为未名兴旺系统作物设计前沿实验室提供的京科糯2000DNA，材料S1为深圳作物分子设计育种研究院提供的甜糯玉米圳黑甜糯DNA。本专利技术还提供了一种基于HRM技术的鲜食玉米糯性基因Wx1检测的PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含一对检测引物，其引物的序列如SEQIDNO：4和SEQIDNO：5所示，用于检测玉米材料中Wx1基因是否功能缺失，以判断玉米材料是否为糯质或是否为Wx1基因缺失的甜糯玉米自交系材料。本专利技术还提供了一种试剂盒的使用方法，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：a)提取待测样本DNA；b)配制包含待测样品DNA、检测引物对、PCR试剂盒和EvaGreen荧光染料的PCR反应体系进行PCR扩增；c)对PCR产物进行HRM分析扫描。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及效果：(1)精准。本技术方法可以精确分析糯玉米与非糯玉米自交系。(2)便捷。本研究方法可以在短时间内区分不同性质玉米自交系。(3)高效。本专利技术的方法可将不同种质资源进行明显的划分，方便育种、生产和商业推广应用。(4)用途广。利用本专利技术的方法可检测糯玉米材料，又可根据育种目标选择新型甜糯玉米自交系、商用杂交种等。此方法灵敏度高、重复性好，相较SSR分子标记法灵敏度差，RAPD-PCR法灵敏度低、实验重复性差，具有检测更为准确的优点。因此，本专利技术是一种简单、快捷、准确的检测方法，代替之前的检测方法，将有助于糯玉米自交系育种资源的选育和鉴别技术的推广应用。参考文献1.Kim,K.,etal.,MolecularcloningandcharacterizationoftheAmylose-ExtendergeneencodingstarchbranchingenzymeIIBinmaize.PlantMolecularBiology,1998.38(6):p.945-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Wx1基因的检测引物，其特征在于所述引物的正向引物是5'-CAGGCTGGAAGAGCAGAAGG-3'，反向引物是5'-CACACGTACCAGCAGAACGAT-3'。/n

【技术特征摘要】
1.一种Wx1基因的检测引物，其特征在于所述引物的正向引物是5'-CAGGCTGGAAGAGCAGAAGG-3'，反向引物是5'-CACACGTACCAGCAGAACGAT-3'。


2.一种Wx1基因的HRM检测方法，其特征在于所述HRM检测体系包含一对检测引物，所述检测引物的正向引物是5'-CAGGCTGGAAGAGCAGAAGG-3'，反向引物是5'-CACACGTACCAGCAGAACGAT-3'。


3.根据权利要求2所述的HRM检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)提取待测样本DNA；
b)用检测引物对进行PCR扩增；和
c)对PCR产物进行HRM分析扫描。


4.一种基于HRM技术的Wx1基因的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒中包含一对检测引物，所述检测引物的正向引物是5'-CAGGCTGGAAGAGCAGAAGG-3'，反向引物是5'-CACACGTACCAGCAGAACGAT-3'。


5.权利要求4所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于所述使用方法包括如下步骤：
a)提取待测样本DNA；
b)配制包含待测样品DNA、检测引物对、PCR试剂和EvaGreen荧光染料的PCR反应体系进行PCR扩增；
c)对PCR产物进行HRM分析扫描。


6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其中所述的提取待测样品DNA的方法是取样品的幼嫩叶片，用液氮充分研磨，然后采用CTAB法进行提取。


7.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈舜权，唐晓艳，高彩吉，黎杰强，陈竹锋，金名捺，杨超，许纯珏，杨帆，
申请(专利权)人：华南师范大学，深圳市作物分子设计育种研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44