一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法技术

本发明专利技术适用于毕赤酵母基因研究技术领域，提供了一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，通过依次复活菌株GS115和pPIC9K、培养菌株GS115和pPIC9K、合成EHT1引物、提取及鉴定菌株GS115和pPIC9K的总RNA、反转录毕赤酵母总RNA并扩增EHT1CDS区，从而方便进行后续的EHT1的进化关系分析，本发明专利技术的实验方法可以应用于发酵工程菌。

【技术实现步骤摘要】
一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法
本专利技术属于毕赤酵母基因研究
，尤其涉及一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法。
技术介绍
EHT1和EEB1编码乙酯合成酶/水解酶，单一和多重缺失分析暗示Eht1和Eeb1在MCFA乙酯生物合成中的作用，且集中在两种基因产物上。纯化GST-Eht1和GST-Eeb1融合蛋白获得结果清楚地表明，这些蛋白具有调控MCFA乙酯合成和水解两种酶活性。这与单个和多个缺失菌株中MCFA乙酯分析结果一致。EHT1或EEB1的缺失，特别是双缺失导致大部分MCFA乙酯的产生显著降低。Eht1酶对MCFA乙酯的生产具有最大的贡献。先前研究已经证实，基因ATF1、Lg-ATF1(仅存在于贮藏酵母中)和ATF2编码乙酸酯合酶。然而，ATF1和ATF2的双缺失不影响MCFA乙酯合成。鉴于eht1Δeeb1Δ双缺失突变体中的残余活性，在酵母中仍然存在涉及酯生物合成的未知基因。对从各种食品中分离到的酵母菌株进行挥发性香气成分检测，发现可以产生多种酯类物质如辛酸乙酯和己酸乙酯等。分析酵母中控制酯类合成的酶发现EHT1和EEB1主要控制中短链的脂肪酸酯，前期研究EHT1和EEB1基因的分布发现EHT1基因在所有菌株中均存在，而EEB1基因只在部分酵母菌株中存在，推测EHT1基因是酵母合成酯类所必需基因。因此分析毕赤酵母中EHT1基因进化关系，对其应用于发酵工程菌中具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，旨在分析毕赤酵母中EHT1基因进化关系，并应用于发酵工程菌。本专利技术是这样实现的，一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，包括以下步骤：S1、复活菌株GS115和pPIC9K；S2、培养菌株GS115和pPIC9K；S3、合成EHT1引物；S4、提取及鉴定菌株GS115和pPIC9K的总RNA；S5、反转录毕赤酵母总RNA，并扩增EHT1CDS区。优选的，其特征在于：步骤S1具体包括：将菌株GS115和pPIC9K冻干管从4℃冰箱冷藏室取出，75％酒精棉擦拭冻干管表面，将管顶端用酒精灯外焰均匀加热；在冻干管加热部位立即滴加2–3滴无菌水；移取500μL5°Bé麦芽汁液体培养基加入冻干管中，使菌株GS115和pPIC9K冻干粉全部溶解；将溶解后的菌株GS115和pPIC9K悬浮液转移到5mLEP管中，加入5,000μL5°Bé麦芽汁液体培养基，混匀。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，通过复活菌株GS115和pPIC9K、培养菌株GS115和pPIC9K、合成EHT1引物、提取及鉴定菌株GS115和pPIC9K的总RNA、反转录毕赤酵母总RNA并扩增EHT1CDS区，从而方便进行后续的EHT1的进化关系分析，可以应用于发酵工程菌。附图说明图1为本专利技术的具体实施方式的毕赤酵母EHT1测序结果示意图。图2为本专利技术的具体实施方式的EHT1氨基酸序列示意图。图3为本专利技术的具体实施方式的EHT1多序列比对结果图。图4为本专利技术的具体实施方式的EHT1的进化历史示意图。图5为本专利技术的具体实施方式的酿酒酵母和毕赤酵母中EHT1完整序列的比对的示意图。图6为本专利技术的具体实施方式的目标蛋白质和其他蛋白质之间共有的结构域的示意图。图7为本专利技术的具体实施方式的目标基因和其他基因之间共有的GO生物过程的示意图。图8为本专利技术的具体实施方式的基于所共享的表型观察量，在给定基因和其他基因之间共有的表型观察示意图。图9为本专利技术的具体实施方式的给定基因与其相互作用因子之间的物理和遗传相互作用示意图和给定基因的相互作用者之间的相互作用示意图。图10为本专利技术的具体实施方式的给定基因的目标和调节物之间的关系图。图11为本专利技术的具体实施方式的基于给定基因和共享表达谱的基因之间相关表达谱的基因网络示意图。图12为本专利技术的具体实施方式的不同碳源在不同采样时间和R1-R3处的PichiamanshuricaEHT1基因表达水平示意图。图13为本专利技术的具体实施方式的一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法部分流程示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。请参阅图13，本专利技术提供一种技术方案：一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，采用的毕赤酵母菌株GS115和pPIC9K均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC1352。菌种特征：不发酵葡萄糖，半乳糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、乳糖和松三糖，同化葡萄糖、甘油和乙醇，不同化木糖，包括以下步骤：S1、复活菌株GS115和pPIC9K。将菌株GS115和pPIC9K冻干管从4℃冰箱冷藏室取出，75％酒精棉擦拭冻干管表面，将管顶端用酒精灯外焰均匀加热。在冻干管加热部位立即滴加2–3滴无菌水。移取500μL5°Bé麦芽汁液体培养基加入冻干管中，使菌株GS115和pPIC9K冻干粉全部溶解。将溶解后的菌株GS115和pPIC9K悬浮液转移到5mLEP管中，加入5,000μL5°Bé麦芽汁液体培养基，混匀。S2、培养菌株GS115和pPIC9K。宿主毕赤酵母菌株GS115和pPIC9K在YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％右旋糖)和BMGY培养基(1％甘油、1％YE、2％蛋白胨、1.34％酵母氮源、无氨基酸和铵硫酸盐(YNB)，pH6.0的0.0004％生物素和100mM磷酸钾缓冲液)或作为诱导培养基的BMMY(甲醇代替甘油)。宿主毕赤酵母菌株GS115和pPIC9K的生长条件是28-30℃，摇动300r/min。S3、合成EHT1引物。根据NCBIGenbank中毕赤酵母(Pichiamanshurica)EHT1的序列(登录号：FR839628)，设计引物EHT1_EcoRI_F(5’-TTTGAATTCATGCCATCTTGGGGGTTCC-3’)和EHT1_NotI_R(5’-ATAAGAATGCGGCCGCAATTCCAGTTTTATAGCTG-3’)。正向和反向引物分别加入EcoRI和NotI位点。S4、提取及鉴定菌株GS115和pPIC9K的总RNA。将毕赤酵母菌株GS115和pPIC9K大量培养后，2,000r/min离心2min(目的是使菌体浓缩至离心管底部，取出上清培养基)，使用液氮对离心后毕赤酵母菌体GS115和pPIC9K进行研磨，研钵在使用前在-20℃冰箱冷冻室中冷冻2h，取出研钵后使用0.1％DEPC配制的医用酒精棉彻底擦拭干净。提取毕赤酵母菌株GS115和pPIC9K总RNA的所有操本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1、复活菌株GS115和pPIC9K；/nS2、培养菌株GS115和pPIC9K；/nS3、合成EHT1引物；/nS4、提取及鉴定菌株GS115和pPIC9K的总RNA；/nS5、反转录毕赤酵母总RNA，并扩增EHT1 CDS区。/n

【技术特征摘要】
1.一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、复活菌株GS115和pPIC9K；
S2、培养菌株GS115和pPIC9K；
S3、合成EHT1引物；
S4、提取及鉴定菌株GS115和pPIC9K的总RNA；
S5、反转录毕赤酵母总RNA，并扩增EHT1CDS区。


2.如权利要求1所述的一种毕赤酵母中EHT1基因进化关系分析的实验方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈嘉，冯志宏，焦旋，高振峰，施俊凤，杨志国，张立新，秦一帆，张茜，闫钊，
申请(专利权)人：山西省农业科学院农产品贮藏保鲜研究所，
类型：发明
国别省市：山西;14