雪胆三萜合成酶HcOSC6基因及其工程菌和在制备葫芦二烯醇中的应用制造技术

本发明专利技术公开了雪胆三萜合成酶HcOSC6基因及其工程菌和在制备葫芦二烯醇中的应用。该雪胆三萜合成酶HcOSC6基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该工程菌能够表达该雪胆三萜合成酶HcOSC6。在以D‑葡萄糖和D‑半乳糖为碳源的培养基中，本发明专利技术的转基因工程菌能够在细胞内表达雪胆三萜合成酶HcOSC6，在雪胆三萜合成酶HcOSC6的催化下，酵母内源的底物2,3‑氧化鲨烯会发生环化反应，生成葫芦二烯醇，葫芦二烯醇产量约为5.5mg/L，不仅提供了生产葫芦二烯醇的重要途径，而且为雪胆素等葫芦素的生物合成提供了丰富原材料。

【技术实现步骤摘要】
雪胆三萜合成酶HcOSC6基因及其工程菌和在制备葫芦二烯醇中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种雪胆三萜合成酶HcOSC6基因及其工程菌和在制备葫芦二烯醇中的应用。
技术介绍
葫芦科植物中含有众多对人类生产生活具有重要作用的次级代谢产物，如：(1)葫芦素(cucurbitacins)，葫芦素初是从葫芦科植物中分离的苦味物质，后来发现葫芦素也存在于十字花科等植物中，一方面，葫芦素具有显著的抗癌活性，是一种极具潜力的新药候选化合物，其中最具代表性的是从雪胆属植物中分离提取获得的葫芦素IIa(25-acetoxy-23,24-dihydrocucurbitacinF)和葫芦素IIb(23,24-DihydrocucurbitacinF)，这两者是葫芦素开发和利用中最有效的新型抗菌药物，同时，葫芦素IIa还能通过抑制JAK2/STAT3下游的生存素(Survivin)，从而抑制肿瘤细胞的增殖，使其成为一类新型的抗癌药物；另一方面，作为葫芦科中的苦味物质，极低含量的葫芦素(0.1mg/L)就能引起明显的苦味，从而提高瓜类植物的抗病性；(2)罗汉果苷，罗汉果苷分离自葫芦科植物罗汉果，罗汉果苷具有很强的甜味，是糖尿病患者的潜在糖类替代品。葫芦素和罗汉果苷都是一类以葫芦二烯醇为骨架的四环三萜类化合物，研究认为，这类化合物的合成途径起始于2,3-氧化鲨烯，先经氧化鲨烯环化酶(OSCs)形成三萜骨架葫芦二烯醇(Cuol)，而后在CYP450氧化还原酶、甲基转移酶、酰基转移酶(BAHD-AT)以及糖基转移酶的作用下，形成不同的葫芦素或罗汉果苷。可见，葫芦二烯醇是葫芦素以及罗汉果苷等四环三萜类化合物的生物合成的重要中间体，不仅如此，葫芦二烯醇本身也具有显著的抗炎、抗肿瘤作用。虽然葫芦二烯醇、葫芦素、罗汉果苷等人类生产生活具有重要作用，然而其中许多的四环三萜类化合物，如雪胆素(葫芦素IIa和葫芦素IIb)，在雪胆属植物中的含量极低。对其进行分离提取需要采集大量的植物原材料，且提取工艺又较为复杂，同时植物原材料种植周期又长，对种植地块和种植技术的要求较高，这就严重阻碍了对雪胆素的开发利用。目前，对于高附加值的天然产物，采用现代生物技术建立同源或异源表达系统高效生产药用活性成分，已被广泛认为是解决今后药用资源短缺的重要技术手段。不过雪胆属植物中的雪胆素生物合成途径一直未见报道，尤其是负责形成雪胆素碳骨架的OSCs的基因功能不清楚，影响了雪胆素生物合成工作的推进。
技术实现思路
本申请的专利技术目的是提供一种雪胆三萜合成酶HcOSC6基因及其工程菌和在制备葫芦二烯醇中的应用，提供了一种葫芦二烯醇的制备途径，为葫芦素Iia的生物合成提供了丰富原材料。为实现上述专利技术目的，本申请的技术方案如下：雪胆三萜合成酶HcOSC6基因，具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本专利技术的雪胆三萜合成酶HcOSC6基因是从雪胆的块茎中，通过转录组测序及生物信息学技术，经大量实验后筛选后，得以鉴定获得的。提取时，先提取雪胆块茎的总RNA，再反转录为cDNA，cDNA经PCR扩增后获得所述雪胆三萜合成酶HcOSC6基因；PCR扩增所采用的特异性引物为：上游引物：5'-ATGTGGAAGTTAAAGATAGGAGGAG-3'(SEQIDNo.3)；下游引物：5'-TCAGAATAAAGCGGCCGGATG-3'(SEQIDNo.4)。本专利技术还提供了含有上述的雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的重组载体。该重组载体可以是重组质粒，该重组质粒的原始质粒可以选用pYES2。本专利技术还提供了雪胆三萜合成酶HcOSC6，该雪胆三萜合成酶HcOSC6具有如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本专利技术还提供了表达所述的雪胆三萜合成酶HcOSC6的转基因工程菌。在以D-葡萄糖和D-半乳糖为碳源的培养基中，本专利技术的转基因工程菌能够在细胞内表达雪胆三萜合成酶HcOSC6，在雪胆三萜合成酶HcOSC6的催化下，酵母内源的底物2,3-氧化鲨烯会发生环化反应，生成葫芦二烯醇；葫芦二烯醇产量约为5.5mg/L酵母培养物，远远高于雪胆属植物的产量，不仅提供了生产葫芦二烯醇的重要途径，而且为雪胆素等葫芦素的生物合成提供了丰富原材料。葫芦二烯醇的结构式如下：在上述的表达雪胆三萜合成酶HcOSC6的转基因工程菌中，雪胆三萜合成酶HcOSC6基因可以是是以重组质粒存在的，也可以直接整合原始菌的基因组中。即，所述的转基因工程菌可以包含有上述的含有雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的重组载体，也可以在其基因组中整合有上述的雪胆三萜合成酶HcOSC6基因。本专利技术中，上述的表达雪胆三萜合成酶HcOSC6的转基因工程菌的原始菌为酿酒酵母，可以选用酿酒酵母GIL77菌株。本专利技术还提供了上述的雪胆三萜合成酶HcOSC6基因在制备葫芦二烯醇中的应用，以及上述的表达雪胆三萜合成酶HcOSC6的转基因工程菌在制备葫芦二烯醇中的应用。其中，雪胆三萜合成酶HcOSC6基因在制备葫芦二烯醇中的应用即是构建转基因工程菌，而上述的表达雪胆三萜合成酶HcOSC6的转基因工程菌在制备葫芦二烯醇中的应用则包括：(1)将所述的表达雪胆三萜合成酶HcOSC6的转基因工程菌接种至以D-葡萄糖和D-半乳糖为碳源的培养基中，发酵培养；(2)将培养物离心，取工程菌细胞，作破壁处理，获得胞内产物混合液；(3)对所述的胞内产物混合液进行分离纯化，获得所述的葫芦二烯醇。本专利技术通过重组质粒，并在酿酒酵母体内表达目标蛋白雪胆三萜合成酶HcOSC6，雪胆三萜合成酶HcOSC6进一步对酵母内源高积累底物2,3-氧化鲨烯进行环化反应，直接生成葫芦二烯醇。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：本专利技术鉴别获得雪胆三萜合成酶HcOSC6基因，并构建获得表达雪胆三萜合成酶HcOSC6的转基因工程菌，在以D-葡萄糖和D-半乳糖为碳源的培养基中，本专利技术的转基因工程菌能够在细胞内表达雪胆三萜合成酶HcOSC6，在雪胆三萜合成酶HcOSC6的催化下，酵母内源的底物2,3-氧化鲨烯会发生环化反应，生成葫芦二烯醇；葫芦二烯醇产量约为5.5mg/L酵母培养物，不仅提供了生产葫芦二烯醇的重要途径，而且为雪胆素等葫芦素的生物合成提供了丰富原材料。附图说明图1为含有本专利技术雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的重组质粒的电泳检测结果；其中，Marker表示标准品，下同；图2为含有本专利技术雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的重组质粒的结构示意图；图3为本专利技术转基因工程菌的胞内提取物的TCL检测图；其中，1：Ergosterol为培养基中麦角固醇补充剂，2,3-Oxidosqualene为酵母中内源2,3-氧化鲨烯底物，2和3为空质粒对照；4和5为HcOSC6基因提取物，黑色箭头为目的产物；图4为本专利技术转基因工程菌的胞内提取物GC-MS检测图；其中，standa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.雪胆三萜合成酶HcOSC6基因，其特征在于，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.雪胆三萜合成酶HcOSC6基因，其特征在于，具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。


2.含有如权利要求1所述的雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的重组载体。


3.雪胆三萜合成酶HcOSC6，其特征在于，具有如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。


4.表达如权利要求3所述的雪胆三萜合成酶HcOSC6的转基因工程菌。


5.如权利要求4所述的表达雪胆三萜合成酶HcOSC6的转基因工程菌，其特征在于，包含有如权利要求2所述的含有雪胆三萜合成酶HcOSC6基因的重组载体。


6.如权利要求4所述的表达雪胆三萜合成酶HcOSC6的转基因工程菌，其特征在于，基因组中整合有如权利要求1所述的雪胆三萜合成酶HcOSC6基因。


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【专利技术属性】
技术研发人员：张广辉，陈庚，杨生超，赵艳，段绍凤，刘冠泽，郭兆宽，李莹，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53