一株肠杆菌株及其在合成2,3-丁二醇中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株肠杆菌Kosakonia cowanii，菌株号LT‑1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏号为CCTCC No：M 2017850，保藏日期为2017年12月29日。本发明专利技术还公开了肠杆菌在合成2,3‑丁二醇中的应用。该菌株以葡萄糖为碳源，酵母粉为氮源发酵合成2,3‑丁二醇的产量可达到42.56～212.49g/L。本发明专利技术的优点在于，发酵合成2,3‑丁二醇所使用的菌株为：肠杆菌K.cowanii LT‑1，该菌株的发酵特点在于，发酵合成2,3‑丁二醇产量高，副产物少，不仅降低了生产成本而且还有利于2,3‑丁二醇的纯化。本发明专利技术所述操作方法简单，成本较低，极具工业化推广应用前景，同时为2,3‑丁二醇的生物合成提供一种新工艺。

【技术实现步骤摘要】
一株肠杆菌株及其在合成2,3-丁二醇中的应用
本专利技术具体涉及一株肠杆菌株及其在合成2,3-丁二醇中的应用，属于微生物学、生物工程技术和化工

技术介绍
2,3-丁二醇(2,3-Butanediol)是一种极具价值的液体燃料，燃烧值仅次于乙醇且高于甲醇，达27,200kJ/kg；2,3-丁二醇也是一种极有潜力的化工原料，可用于生产抗冻剂、高级航空油；2,3-丁二醇可以清除自由基、阻断过氧化反应，因而被广泛地应用于化妆品、洗液等行业；此外，2,3-丁二醇还可以用作高价值香料的食品添加剂和医药中间体。随着石油需求量的不断增加，而石油又作为不可再生的能源。因此，用人工生产方法获取石油产品，将为社会发展提供一种新的能源开发思路。2,3-丁二醇主要的生产方法有化学合成法和生物发酵法。化学合成法生产2,3-丁二醇是以石油裂解时产生的四碳类氢化合物在高温、高压下水解生成，该方法生产成本高、过程繁琐不易操作、副产物多，因此难以大规模工业化生产，从而限制2,3-丁二醇的开发应用。而本专利技术的肠杆菌K.cowaniiLT-1能够通过微生物发酵技术生产2,3-丁二醇，不仅克服了化学生产成本高、不易操作的困难，而且利用微生物合成发酵生产2,3-丁二醇更加经济化、更具有环保意义。经检索，目前未见有使用肠杆菌K.cowanii发酵生产2,3-丁二醇的专利报道。
技术实现思路
针对于现有技术不足，本专利技术解决的问题是：提供了一株肠杆菌K.cowaniiLT-1及其所述菌在制备2,3-丁二醇中的应用。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述肠杆菌的应用。为解决上述问题，本专利技术采取的技术方案如下：专利技术人在2017年从酒糟中筛选得到一株肠杆菌，菌株号为KosakoniacowaniiLT-1，已保藏于“中国典型培养物保藏中心”(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，邮编：430072，登记入册的保藏号为CCTCCNo：M2017850，保藏日期为2017年12月29日。以下内容均以此菌株作为生产菌株。1、菌落形态学特征与生理生化特性见表1。表1菌落形态学特征与生理生化特性2、16SrDNA序列分析：测得菌株的16SrDNA基因的核普酸序列长度为1388bp，其基因序列如SEQIDNo.1：所示。将所测序列从GeneBank数据库中使用BLAST程序进行同源性比较，构建16SrDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与肠杆菌HME8565达到100％同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本专利技术所使用的是肠杆菌，具体为肠杆菌K.cowaniiLT-1。上述肠杆菌K.cowaniiLT-1在发酵合成2,3-丁二醇的应用也在本专利技术的保护范围之内。具体的应用方法为，将肠杆菌LT-1接种于斜面固体培养基，转接到种子培养基，最后接种于发酵培养基中进行好氧培养，发酵液中富含有2,3-丁二醇。本专利技术所述肠杆菌K.cowaniiLT-1及其所述菌在制备2,3-丁二醇的应用，依次包括以下步骤：1.培养基的配制：(1)斜面培养基成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，自来水配制，调整pH值至7.0～7.2，115℃灭菌20min；(2)液体种子培养基为：碳源10～30g/L，氮源4～8g/L，金属盐1.0～2.5g/L，自来水配制，调整pH值至7.0～7.2，115/121℃灭菌20min；(3)富集液体培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉8g/L，硝酸钠3g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化钙0.2g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂粉20g/L，自来水配制，调整pH值至7.0～7.2，115℃灭菌20min；(4)富集固体培养基为：富集液体培养基、琼脂粉20g/L，自来水配制，调整pH值至7.0～7.2，115℃灭菌20min；(5)固体种子培养基为：液体种子培养基，琼脂粉20g/L，自来水配制，调整pH值至7.0～7.2，115/121℃灭菌20min；(6)发酵培养基：葡萄糖140g/L，酵母粉6g/L，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，氯化钙0.3g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.04g/L，自来水配制，pH值调至7.0～7.2，115℃灭菌20min；2.菌种选择：选已保藏菌株肠杆菌K.cowaniiLT-13.菌种活化：将肠杆菌K.cowaniiLT-1菌种接种于斜面培养基，24～36℃静置培养24～36h，再次挑取单菌落划线到普通固体培养基上，24～36℃培养24～36h，得到活化菌种备用；4.摇瓶发酵种子液培养：取步骤3中活化好的菌种，无菌条件下接种2～4环于种子液的摇瓶中，置于转速为220rpm的摇床上，温度为28～38℃培养24h，得到发酵种子液；5.发酵培养：摇瓶发酵培养：将上述发酵种子液在无菌条件下以4％～10％体积比的接种量，将种子液接种于发酵培养基摇瓶中，置于转速为220rpm的摇床上，28～38℃培养36～48h；当发酵液中丁二醇浓度不再上升时，停止发酵；6.2,3-丁二醇的提取：取步骤5中的发酵液，离心除菌后对清液进行减压蒸馏，获得30～55％的浓缩液，再加入等体积的45％的K2HPO4/乙醇体系，形成双相体系，将上相中的溶液进行蒸馏，得2,3-丁二醇。7.2,3-丁二醇含量测定：取步骤5中的发酵液，12,000rpm离心20min除去菌体，上清用0.22μm的滤膜过滤，置于进样瓶中待用。样品采用示差检测器检测，色谱柱：AminexHPX-87H(300×7.8mm)；流动相：0.05M的H2SO4；流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：60℃。有益效果：本专利技术具有如下优势：(1)本专利技术筛选得到一株产2,3-丁二醇的菌株，该菌株能够以葡萄糖为碳源、酵母粉氮源，发酵合成2,3-丁二醇，副产物少，有利于2,3-丁二醇的纯化，社会和经济效益显著。(2)该菌株发酵合成2,3-丁二醇的产量可达到42.56～212.49g/L，葡萄糖转化率最高达62.50％，大大降低了生产成本低，而且操作简单，这对于2,3-丁二醇的生产和拓展应用具有十分重要的意义。附图说明图1为肠杆菌LT-1的16SrDNAPCR纯化琼脂糖凝胶电泳图(A)和肠杆菌LT-1的系统发育树(B)。图2为肠杆菌LT-1产2,3丁二醇高效液相色谱图。图3为肠杆菌LT-1产2,3-丁二醇的红外光谱图。图4为肠杆菌LT-1摇瓶水平合成2,3-丁二醇进程曲线。图5为50L发酵罐分批补料合成2,3-丁二醇进程曲线。图6为1t发酵罐分批补料合成2,3-丁二醇进程曲线。具体实施方式：可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株肠杆菌，该菌株命名为肠杆菌Kosakonia cowanii LT-1，菌株已于2017年12月29日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC No：M 2017850。/n

【技术特征摘要】
1.一株肠杆菌，该菌株命名为肠杆菌KosakoniacowaniiLT-1，菌株已于2017年12月29日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCCNo：M2017850。


2.权利要求1所述肠杆菌在制备2,3-丁二醇的应用。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌株活化：
(2)种子培养：
(3)发酵培养：将步骤(2)中种子液接种到发酵培养基，发酵42～84h，可得含有2,3-丁二醇的发酵液；
所述发酵培养基包括如下组分：碳源80～140g/L，氮源4～8g/L，金属盐1～2.5g/L，pH值7.0～7.2，余量为水；
所述碳源为甘油、葡萄糖、乳糖的任意一种或几种的组合；所述氮源为牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、黄豆粉、小麦胚芽粉、花生饼粉、酵母粉中的任意一种或几种的组合；金属盐为硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锰、氯化钙、硝酸钠中的一种或多种。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，菌株活化的培养条件如下：
将肠杆菌K.cowaniiLT-1接种到斜面培养基上，24～36℃静置培养24～36h，再次挑取单菌落划线到种子培养基上，24～36℃培养24～36h，得到活化菌种备用；
斜面培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴凌天，卢成慧，杜悦，黎宇航，吴金男，徐悦，石悦，
申请(专利权)人：常熟理工学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32