一种针对胸膜肺炎放线杆菌保护猪的疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)感染的疫苗，所述疫苗包含由杆状病毒重组表达的胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素，以及药学上可接受的载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种针对胸膜肺炎放线杆菌保护猪的疫苗
一般而言，本专利技术涉及一种保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)感染的疫苗。
技术介绍
本专利技术涉及针对猪胸膜肺炎的疫苗，猪胸膜肺炎是一种对养猪业造成重大经济损失的世界范围的疾病。猪胸膜肺炎的病原体是胸膜肺炎放线杆菌(APP)，一种属于巴斯德氏菌科(familyPasteurellaceae)的革兰氏阴性菌。该疾病通过气溶胶途径或与感染猪的直接接触传播，并以出血、纤维化和坏死性肺病变为特征。临床表现可以从超急性到慢性范围，当将无症状携带猪引入未感染种群中时，其可以传播疾病。根据荚膜多糖和脂多糖(LPS)O链组分，已经描述了15种血清型。对胸膜肺炎放线杆菌的血清分型和其他基因分型方法为监测和流行病学研究做出了巨大贡献。这些工具为控制程序中旨在消除细菌毒性类型的决策提供了重要信息。据报道，在北美，血清型1、5和7是最普遍的，而血清型2和9在欧洲最常见，血清型15是澳大利亚猪的主要分离株。针对胸膜肺炎放线杆菌描述的毒力因子包括LPS、荚膜多糖、Apx毒素I-IV(也称为重复毒素或RTX毒素)、外膜蛋白(OMP)和各种铁捕获系统。Frey已在TrendsinMicrobiology257,Vol.3,No.7,July1995中描述了胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素(Apx毒素I、II和III)。随后，发现了APP的第四种RTX毒素(称为ApxIV)(参见，Dreyfus等，VeterinaryMicrobiology,2004,April19；99(3-4):227-238)。然而，每种组分对感染过程的总体贡献仍不清楚，对这种菌的发病机制也不清楚。目前，针对A.pleuropneumoniae的几乎所有可用疫苗都是灭活的全细胞细菌素或Apx毒素与蛋白的亚单位组合，任选地与外膜级分组合。在任何情况下，已经普遍理解，为了获得足够的保护，在疫苗中必须存在脂多糖(LPS)(JulienGouré等，BMCGenomics2009,10:88，2009年2月24日发表；Dubreuil等，AnimalHealthResearchReviews1(2):73-93,2000年12月)。实际上，已知LPS与Apx毒素之间的特异性结合在改善毒素免疫原性方面具有重要作用(参见，i.a.Ramjeet等，MolecularBiology,2008,70(1),pp221-235)，其可能解释了其中Apx毒素与LPS形成复合物的组合亚单位疫苗具有充分的保护作用。脂多糖的严重缺点是其内毒素性质，因此与多种不良副作用如嗜睡、腹泻、呕吐、食欲不振或者甚至死亡有关。因此，乍看之下，应试图降低疫苗中LPS的量或使LPS解毒。然而，适当的APP疫苗依赖于LPS的存在，因而，众所周知，降低LPS的量会固有地降低疫苗的有效性。替代地，如从WO2011/015614中所知晓地，可以通过向疫苗中添加抗生素多粘菌素来消除LPS的负面影响。但是，从监管的角度来看，在疫苗中添加抗生素受到严格限制。因此，这种解决方案不能在所有监管辖区中使用。实际上，当前的理解是，要达到如此高的保护水平，疫苗中必须存在至少一种Apx毒素，该毒素存在于与异源分子(如LPS)的免疫复合物中。尽管已知纯化的Apx毒素可以提供一定程度的保护作用(参见，i.a.Bhatia等，VeterinaryMicrobiology,29,1991,147-158)，但是为了获得充分的保护，理解在疫苗中使用纯化的Apx毒素作为抗原是不够的。已知有很多在革兰氏阴性细菌大肠杆菌中表达Apx毒素的实例。尽管有时指由大肠杆菌生产的“纯化的”重组Apx毒素，但是在每种这些情况下，由于与大肠杆菌细菌细胞壁中所含的LPS接触，毒素会与LPS形成复合物。用于真正获得不与LPS或另一种异源毒素复合的纯化Apx毒素的更独特的表达系统在本领域中也是公知的。Kyung-YeolLee等在FEMSImmunolMedMicrobiol48,2006,381-389中描述了使用在转基因烟草植物中生产的重组Apx毒素诱导针对胸膜肺炎放线杆菌感染的保护性免疫应答。但是，没有显示出对猪的保护作用。另外，疫苗需要以口服方式连续给药四次。对于给猪接种疫苗，这是不现实的选择。相应地，Mi-YoungKim等在ProteinExpressionandPurification132,2017,116–123中指出，Apx毒素能够在转基因水稻愈伤组织中表达，当鼻内施用时，纯化的毒素在小鼠中能够针对胸膜肺炎放线杆菌感染提供至少一些保护作用。但是，其没有显示出对猪的保护作用，更不用说与商业上可用于预防APP的疫苗产生相当水平的保护作用。专利技术目的本专利技术的目的是提供一种替代疫苗，以充分保护仔猪免受胸膜肺炎放线杆菌的感染，优选地以与使用市售APP疫苗所达到的保护水平相当的水平。
技术实现思路
为了达到本专利技术的目的，已经设计出一种保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌感染的疫苗，所述疫苗包含由杆状病毒重组表达的胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素和药学上可接受的载体。令人吃惊的是，包含分离的毒素，但不存在LPS或另一种异源毒素的目前的疫苗可以产生充分的保护作用，甚至达到与使用疫苗如APP(荷兰Boxmeer的MSDAnimalHealth)所获得的保护水平相当的水平。尽管杆状病毒表达本身是众所周知的，并且已经使用了很多年以表达病毒或细菌病原体的免疫原，但是尚未用于通过表达一种或多种RTX毒素提供针对APP的适宜疫苗。杆状病毒是能够感染600多种昆虫物种的DNA病毒。在生物技术中最常用的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)。杆状病毒具有环状的双链DNA(～134kb)，其包装在杆状核衣壳内，并被来源于宿主细胞的膜所包裹。感染昆虫后，杆状病毒可以以出芽形式从细胞中释放出来，或者包埋在由病毒表达的多角体蛋白和p10蛋白组成的多面体内。多角体蛋白和p10蛋白表达丰富，但对于杆状病毒复制是非必需的，因此可以在多角体蛋白或p10启动子的控制下克隆异源基因，以产生重组杆状病毒。自1980年代以来，众所周知，所得到的重组杆状病毒可用于感染培养的昆虫细胞以稳健地进行蛋白表达。迄今为止，已经开发了多种商业杆状病毒载体系统(例如，Bac-to-BacTM,Invitrogen；BaculoDirectTM,Invitrogen；ProEasyTM,ABVector)，以使得以“即插即用”形式进行基因克隆和重组杆状病毒构建(例如，参见LinSY,ChenGY,HuYC.RecentPatBiotehnol2011；5:1-11)。此外，已经开发了多种工程化的杆状病毒载体，如flashBACTM和flashBACGOLDTM(OxfordExpressionTechnologiesLtd)，以通过缺失杆状病毒基因组中的某些病毒基因(例如，chiA和v-cath)改善重组蛋白的表达(例如，参见HitchmanRB,PosseeRD,KingLA.RecentPatBi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)感染的疫苗，所述疫苗包含由杆状病毒重组表达的胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素，和药学上可接受的载体。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171220 EP 17209021.91.一种保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)感染的疫苗，所述疫苗包含由杆状病毒重组表达的胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素，和药学上可接受的载体。


2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述RTX毒素是ApxI。


3.一种由杆状病毒重组表达的胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素,其用于一种方法，所述方法通过向动物施用包含所述RTX毒素和药学上可接受的载体的疫苗而保护猪免受胸膜肺炎放线杆菌感染。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·H·威特夫莱特，J·J·E·比杰斯玛，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL