一种排除红脂大小蠹线粒体假基因干扰的长片段扩增引物制造技术

本发明专利技术公开了一种排除红脂大小蠹线粒体假基因干扰的长片段扩增引物。所述引物为DVF7，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；DVR6，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；DVF6，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。本发明专利技术通过设计长片段的扩增引物，避开红脂大小蠹核基因组上的假基因Numts位点进行目的片段的扩增，得到准确的COI基因片段，构建和优化红脂大小蠹基因组DNA长片段扩增反应体系，为分析红脂大小蠹种群遗传变异以及入侵路线提供可靠的研究方法。

【技术实现步骤摘要】
一种排除红脂大小蠹线粒体假基因干扰的长片段扩增引物
本专利技术属于生物基因
，具体涉及一种排除红脂大小蠹线粒体假基因干扰的长片段扩增引物。
技术介绍
红脂大小蠹属于鞘翅目(Coleptera)，小蠹科(Scolytidae)，是我国重大的入侵性林木钻蛀性害虫。1998年在中国山西省阳城，沁水首次发现，推测引入与80年代后期山西从美国引进木材有关。与北美洲发生情况不同的是，它不仅危害树势衰弱的树木，也对健康树进行攻击，导致发生区内寄主的大量死亡。1999年传入河北省、河南省，2001年传入陕西省、青海省，2005年传入北京市，发生区不断向北移，截止2017年已经传到约北纬41.5°的辽宁省凌源、朝阳和内蒙古自治区的赤峰等地。红脂大小蠹虽然目前仅分布在我国的局部地区，但危害相当严重。对尚没有红脂大小蠹发生的地方，红脂大小蠹一旦传入定殖后，将不断地扩大危害。特别是在不利的环境条件和树木生长不良的状况下，虫害的发生将更为严重。如不采取有效的防治办法，被害树木可在较短的时间里死亡，将使多年的绿化成果毁于一旦。因此，对入侵的扩散路线分析和追溯，为有效遏制红脂大小蠹的传播扩散提供理论基础，显得尤为重要。近些年，越来越多的研究已证明分子生物学技术能够为昆虫遗传结构的研究提供。线粒体DNA严格母性遗传，其中的细胞色素氧化酶I基因(COI)具有高度保守，结构稳定，无内含子的特点。因此，扩增COI基因部分序列为标记，对这些群体的遗传结构进行分析，能够追溯其传播扩散路线，为制定有效的防控策略打下基础。前期的研究表明，红脂大小蠹的核基因上存在大量的源于线粒体COI基因的假基因Numts(nuclearmitochondrialpseudogenes)，因此从总基因组DNA中利用通用引物进行PCR扩增COI基因片段，总会扩增到核基因组上的序列，导致得出错误的结论。目前，排除线粒体假基因干扰的方法有直接提取并纯化线粒体DNA，但是并不是所有的组织里都能够成功的获取足够的线粒体DNA，所以相对于提取总DNA来说，该方法成本高且提取效率很低。除此之外还有通过克隆的方式选取单拷贝克隆产物的序列进行比对分析，然而在筛选阳性克隆时，无法识别出以线粒体DNA为模板得到的克隆产物，同样不能有效地避开线粒体假基因位点，得到正确的结果。基于此，目前还并未有高效可行的方法排除红脂大小蠹线粒体假基因的干扰。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种排除红脂大小蠹线粒体假基因干扰的长片段扩增引物及其应用。一种排除红脂大小蠹线粒体假基因干扰的长片段扩增引物，所述引物为DVF7，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示；DVR6，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：2所示；DVF6，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：3所示。一种检测红脂大小蠹线粒体细胞色素氧化酶I基因的试剂盒，包含上述长片段扩增引物。上述长片段扩增引物在追溯红脂大小蠹传播扩散路线中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过设计长片段的扩增引物，避开红脂大小蠹核基因组上的假基因Numts位点进行目的片段的扩增，得到较为准确的COI基因片段，构建和优化红脂大小蠹基因组DNA长片段扩增反应体系，为分析红脂大小蠹种群遗传变异以及入侵路线提供可靠的研究方法。附图说明图1为红脂大小蠹长片段扩增引物筛选图；图中：M：DL5000DNAmarker(从上至下5000,3000,2000,1000,750,500，250,100)；泳道：1-2泳道：引物组A；3-4泳道：引物组B；5-6泳道：引物组C；7-8泳道：引物组D；9-10泳道：引物组E；11-12泳道：引物组F；13-14泳道：引物组G。图2COI基因通用引物测序结果；图中：n表示假基因位点。图3长片段PCR扩增引物测序结果；图中：.表示避开假基因位点所测得的碱基。图4为红脂大小蠹长片段扩增引物DVF7/DVR6扩增不同地区成虫DNA样本电泳检测图；图中，M：DL5000DNAmarker(从上至下5000,3000,2000,1000,750,500，250,100)；泳道：1-8泳道：建平红脂大小蠹DNA样本；9-16泳道：凌源红脂大小蠹DNA样本；17-24泳道：黑里河红脂大小蠹DNA样本。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。实施例1昆虫基因组DNA的提取利用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒(CORNING)提取采自国内建平，凌源，黑里河三个地区红脂大小蠹成虫的基因组DNA。(1)将虫体腹部放入1.5ml离心管中，加入200ulbufferPBS，用研磨棒研磨充分研磨。(2)加入150ulbufferPBS和0.9ulRNaseA后温和地研磨30s。(3)收集350ul研磨好的组织匀浆并转入2ml离心管。如匀浆体积不足350ul，补充PBS至350ul。(4)加入150ulbufferC-L和20ulproteinaseK。立即旋涡震荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管置56℃水浴10min。(5)加入350ulbufferP-D，漩涡震荡30s混合均匀，12000×g离心10min。(6)将DNA制备管置于2ml离心管中，将上步中的混合液转移至制备管中，12000×g离心1min。(7)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500ulbufferW1，12000×g离心1min。(8)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700ulbufferW2，12000×g离心1min，以同样的方法，用700ulbufferW2再洗涤一次。(9)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，12000×g离心1min。(10)弃滤液，将制备管置回原来的2ml离心管中，在制备管膜中央加100ulEluent，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。(11)DNA浓度检测。利用超微量分光光度计检测所提DNA的浓度。使用Nanodrop2000(Thermo公司)，检测前用先用去离子水对检测孔进行清洗，擦干后吸取1ulDNA提取时所用的洗脱缓冲液ElutionBuffer进行修正，修正完成后吸取1ul样品点入检测孔中，将所有DNA分别测定其浓度。实施例2长片段PCR引物的筛选，构建与优化利用PrimerPrimer5软件，以及在线的引物设计程序webprimer(http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer)，基于已获得的红脂大小蠹线粒体全基因组序列，以COI基因为靶标，设计了7对长片段扩增引物(如表1)。表1引物信息表P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种排除红脂大小蠹线粒体假基因干扰的长片段扩增引物，其特征在于，所述引物为DVF7，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；DVR6，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：2所示；DVF6，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种排除红脂大小蠹线粒体假基因干扰的长片段扩增引物，其特征在于，所述引物为DVF7，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示；DVR6，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：2所示；DVF6，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆有庆，陶静，宗世祥，张赛男，焦继鹏，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11