一种基于GDF9基因编码区突变的蒙古羊繁殖力提高方法技术

本发明专利技术公开了一种基于GDF9基因编码区突变的蒙古羊繁殖力提高方法，属于分子生物学领域，可以实现提供提高蒙古羊双羔率的分子标记，检测待测蒙古羊基因组中的GDF9基因编码区启动子下游1040bp处是否存在一个T→C的突变，该位点突变导致核酸序列所对应的氨基酸由苯丙氨酸改变为丝氨酸，以确定蒙古羊个体在该位点的基因型，然后通过基因型筛选种用蒙古羊，采用DNA测序技术，对GDF9基因进行单核苷酸多态性检测，以比较GDF9基因在蒙古羊品种中的多态性，对PCR产物片段进行测序比较分析，寻找到与繁殖力相关的分子标记，利用该分子标记，建立DNA测序检测该基因型的技术体系，并利用该基因型选育种羊，辅助提高蒙古羊繁殖力。

【技术实现步骤摘要】
一种基于GDF9基因编码区突变的蒙古羊繁殖力提高方法
本专利技术涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种基于GDF9基因编码区突变的蒙古羊繁殖力提高方法。
技术介绍
GDF9(growthdifferentiationfactor9，GDF9)即生长分化因子9，与BMP15基因同属于转化生长因子β(TGFβ)超家族成员。绵羊的GDF9基因位于到5号染色体上，全长约2.5kb，其中包含2个外显子和1个内含子，外显子1长397bp，编码134个氨基酸，外显子2长968bp，编码456个氨基酸，内含子长1126bp。蒙古羊是中国数量最多、分布最广的粗毛绵羊品种。原产蒙古高原。现分布内蒙古、东北、华北和西北等地。典型低于行种群包括锡林郭勒的乌珠穆沁羊、苏尼特羊、呼伦贝尔盟的小尾蒙古羊和黑羊等。(张立岭。蒙古羊的群体结构和遗传多态。乌珠穆沁羊产于内蒙古锡林郭勒盟东部乌珠穆沁草原，主要分布在东乌珠穆沁旗、西乌珠穆沁旗等地区，产数已经超过100万只，其适于终年放牧饲养，具有增膘快、蓄积脂肪能力强、产肉率高、性成熟早等特性，适于利用牧草生长旺期，开展放牧育肥或有计划的肥羔生产。同时，乌珠穆沁羊也是做纯种繁育胚胎移植的良好受体羊，后代羔羊体质结实抗病能力强，适应性较好。乌珠穆沁羊系蒙古羊，经过当地的长期选育，已经形成了优良的种群，1982年经过国家农业部、国家标准总局的确认下，正式批准“乌珠穆沁羊”为当地优良品种。2000年，乌珠穆沁羊被农业部评定为国家级畜禽资源保护品种。苏尼特羊产于内蒙古自治区锡林郭勒盟苏尼特左旗和苏尼特右旗，有戈壁羊之称。其主要饲养方式为纯天然牧场自然放牧，气候特点为春季干旱多风、夏季炎热、冬季寒冷，主要饲养植物种类有沙葱、多根葱、小型针茅草等多达477种。苏尼特羊有很强的适应能力，在终年放牧不补任何伺料的条件下都能很快抓膘，而且肌肉丰满，体格壮大，肉质细嫩，无膻味，口感好，有较高的产肉性能。苏尼特羊肉富含人体所需要的各种氨基酸、脂肪酸、矿物质、维生素等，且蛋白质含量高、脂肪含量低，因此在国内外非常受欢迎。1986年苏尼特羊被锡林郭勒盟技术监督局批准为地方良种，1997年被内蒙古自治区人民政府正式命名为苏尼特羊，在2010年被列入全国优良畜种名录，2015年被列入国家级畜禽遗传保护名录。李碧侠等用PCR-SSCP技术分析了GDF9基因在小尾寒羊、湖羊、多赛特和萨福克4个绵羊品种的多态性，结果表明在湖羊、多赛特和萨福克羊GDF9基因外显子1编码区152bp处发生了A→G的突变，导致第51位氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸，小尾寒羊没有发生该突变。Hanrahan等用PCR-SSCP和直接测序的方法在Cambridge绵羊和Belclare绵羊GDF9基因中发现了G1～G8共8个突变，其中有3个核苷酸改变(分别位于编码区471bp处的C→T[G2突变]、477bp处的G→A[G3突变]和978bp处A→G[G5突变])没有导致氨基酸变化；4个G→A的突变导致了氨基酸变化，分别是位于编码区260bp处的突变导致第87位由精氨酸变为组氨酸(G1突变)，编码区721bp处的突变导致第241位由谷氨酸变为赖氨酸(G4突变)，编码区994bp处的突变导致第332位由缬氨酸变为异亮氨酸(G6突变)，编码区1111bp处的突变导致第371位由缬氨酸变为甲硫氨酸(G7突变)；另外编码区1184bp处的C→T碱基突变导致第395位由丝氨酸变为苯丙氨酸(G8突变，FecGH)。管峰等用PCR-RFLP方法研究GDF9基因G8突变在湖羊、夏洛来、多赛特、萨福克、中国美利奴肉用多胎品系、中国美利奴羊和罗姆尼7个绵羊群体中的分布，结果发现仅在湖羊群体中检测到G8纯合突变，但发生率极低(0.645％，2/310)。杨晶采用PCR-SSCP方法分析GDF9基因在小尾寒羊和多赛特羊中的多态性，结果表明在小尾寒羊和多赛特羊GDF9基因外显子2中都检测到了G3突变和编码区729bp处的G→T突变，后者导致243位氨基酸由谷氨酰胺变为组氨酸。高丽霞用PCR-SSCP方法分析GDF9基因外显子2在小尾寒羊、滩羊、同羊和欧拉羊4个绵羊群体中的多态性，结果发现在这4个绵羊品种GDF9基因外显子2编码区558bp和第692bp处都发生了T→C的突变，其中后者导致231位氨基酸由异亮氨酸变为苏氨酸。Nicol等研究发现，FecTT突变是冰岛Thoka绵羊GDF9基因外显子2编码区1279位发生的A→C的突变，FecTT突变纯合子Thoka母羊不育，突变杂合子母羊产羔数比野生型多0.6只。该突变对Thoka绵羊生殖的影响主要表现在三个方面。第一：解剖发现，FecTT突变纯合子(TT)Thoka母羊都存在严重的生殖道畸形现象。表现为子宫没有发育，卵巢小而且未被激活，没有排卵前卵泡和黄体等。第二：TT型母羊卵巢的皮质区域含有大量的原始卵泡，其中许多都被一至两层颗粒细胞包围，且大多数呈现异常形态，也有极少数卵泡被两到四层不对称的颗粒细胞包围。一些TT型卵泡含有相当于正常窦状卵泡大小的卵母细胞，但在高倍镜下观察发现许多卵泡不是已完全瓦解，就是正在瓦解；另一些异常的卵泡中卵母细胞聚集成簇，并被一层颗粒细胞包围。而野生型母羊(++)的卵巢中含有发育到各个阶段的卵泡，在卵泡皮质区域仅可见极少数原始卵泡。第三：与++型母羊相比，FecTT突变使TT型母羊血浆中的促卵泡激素和黄体生成素水平增加，而抑制素A和雌二醇水平下降。TT型母羊颗粒细胞无明显增殖，而在++型母羊中，当卵母细胞增大到直径达80mm时，就会增殖出现许多颗粒和卵泡膜细胞。畅静桃等采用PCR-SSCP和测序的方法在小尾寒羊、白萨福克、特克塞尔和藏羊中都检测到GDF9基因G2突变。陈勇等用PCR-SSCP方法在小尾寒羊，中国美利奴(新疆型)绵羊多胎品系、肉用品系、体大品系，萨福克，无角多赛特，中国美利奴(新疆型)和德国肉用美利奴8个绵羊群体中都检测到了GDF9基因的G4突变。Barzegari等在伊朗的Moghani和Ghezel绵羊群体检测GDF9基因的G1突变。Polley等在印度的Garole绵羊群体中均检测到GDF9基因的G1突变。FecGE是GDF9基因的一种新型突变，是巴西SantaInes绵羊GDF9基因第2外显子编码区1034位发生了G→T改变，从而引起肽链第345位氨基酸残基改变，由半胱氨酸变为苯丙氨酸(C345F)，突变位点正好位于成熟蛋白质内，且该突变能引起排卵数和产羔数的增加，突变纯合子排卵数增加0.82枚，产羔数增加0.58，而突变杂合子及野生型在排卵数和产羔数方面无明显变化。Vage等在挪威白绵羊中研究发现，FecGF突变纯合子人工授精公羊的雌性后代产羔数增加0.46～0.57只，杂合子公羊的雌性后代产羔数增加0.20～0.25只。2013年，Mullen等在Lleyn绵羊中发现FecGH的突变。次年，Mullen等又在在FinnishLandrace绵羊和Belclare绵羊中研究发现，FecGF突变的纯合子和杂合子排卵数都比野生型高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于GDF9基因编码区突变的蒙古羊繁殖力提高方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1、检测待测蒙古羊基因组中的GDF9基因编码区启动子下游1040bp处是否存在一个T→C的突变，该位点突变导致核酸序列所对应的氨基酸由苯丙氨酸改变为丝氨酸，以确定蒙古羊个体在该位点的基因型；/nS2、通过基因型筛选种用蒙古羊，所述GDF9基因的核苷酸序列NCBI ReferenceSequence为NC_019462.2的羊5号染色体，第41767870bp到41770600bp区域；/nS3、若蒙古羊基因组中的GDF9基因编码区启动子下游第1040位核苷酸为T时，则其纯合体的基因型为TT，若蒙古羊基因组中的基因编码区启动子下游第1040位核苷酸为C时，则其纯合体的基因型为CC，其杂合体基因型为TC；/nS4、通过基因型提高蒙古羊繁殖力为：所述CC基因型蒙古羊的平均产羔数高于TC基因型，基因型TC蒙古羊的平均产羔数高于TT型。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于GDF9基因编码区突变的蒙古羊繁殖力提高方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、检测待测蒙古羊基因组中的GDF9基因编码区启动子下游1040bp处是否存在一个T→C的突变，该位点突变导致核酸序列所对应的氨基酸由苯丙氨酸改变为丝氨酸，以确定蒙古羊个体在该位点的基因型；
S2、通过基因型筛选种用蒙古羊，所述GDF9基因的核苷酸序列NCBIReferenceSequence为NC_019462.2的羊5号染色体，第41767870bp到41770600bp区域；
S3、若蒙古羊基因组中的GDF9基因编码区启动子下游第1040位核苷酸为T时，则其纯合体的基因型为TT，若蒙古羊基因组中的基因编码区启动子下游第1040位核苷酸为C时，则其纯合体的基因型为CC，其杂合体基因型为TC；
S4、通过基因型提高蒙古羊繁殖力为：所述CC基因型蒙古羊的平均产羔数高于TC基因型，基因型TC蒙古羊的平均产羔数高于TT型。


2.根据权利要求1所述的一种基于GDF9基因编码区突变的蒙古羊繁殖力提高方法，其特征在于：所述蒙古羊基因组中的GDF91040T＞CSNP的检测方法为：利用PCR方法扩增蒙古羊GDF9基因GenBankAccessionNumber为NC_019462.2的41768565到41767924位核苷酸的片段，并将扩增产物进行DNA测序，若在127bp位置出现单峰且基因型为T，则此基因型为TT，若在127bp处出现套峰，则此基因型为TC，若在127bp位置出现单峰且基因型为C，则此基因型为CC。


3.根据权利要求2所述的一种基于GDF9基因编码区突变的蒙古羊繁殖力提高方法，其特征在于：所述PCR方法的扩增引物对为具有序列1、2所述的核苷酸。


4.根据权利要求1所述的一种基于G...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟彬，李亚星，程子轩，张秀英，任殿玉，朝鲁蒙，
申请(专利权)人：内蒙古大学，锡林浩特市种畜繁育中心，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15