用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组及其应用方法技术

本发明专利技术提供了用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组及其应用方法，该引物组，包括下述至少一个用于检测KRAS基因的引物对和用于检测BRAF基因的引物对：用于检测KRAS基因第2号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；用于检测KRAS基因第3号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；用于检测BRAF基因第15号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。使得基因检测通量提高。

【技术实现步骤摘要】
用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组及其应用方法
本专利技术涉及基因检测
，特别涉及用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组及其应用方法。
技术介绍
研究表明，西妥昔单抗(爱必妥)、帕尼单抗靶向作用于表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)的药物，吉非替尼(易瑞沙)和厄洛替尼(特罗凯)等表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIS)分子靶向药物，仅对未发生KRAS基因突变的患者有效率较高，而对已发生KRAS基因突变的患者则几乎没有反应。而《NCCN结直肠癌临床实践指南》指出，在决定是否用抗EGFR单克隆抗体(西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗前，应先检测肿瘤组织基因突变，对KRAS野生型患者增加BRAF基因突变检测。由于BRAF是KRAS下游的信号传导分子，若BRAF突变则抗EGFR治疗对KRAS野生型患者无效，而对KRAS和BRAF均为野生型的患者效果最好。因此，在进行结直肠癌、肺癌的靶向治疗前进行BRAF基因突变的检测对于判别治疗药物的敏感性有一定的指导意义。目前，可针对KRAS基因的第2号外显子(包含第12、13位密码子)、3号外显子(包含第61号密码子)和BRAF基因的15号外显子(包含第600位密码子)分别设计聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)检测试验，以进行基因突变情况的检测。但是，由于每一个PCR反应只针对KRAS基因或者BRAF基因的一个外显子，故基因突变的检测通量低。<br>
技术实现思路
本专利技术实施例提供了用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组及其应用方法，能够提高基因突变的检测通量。为了达到上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，可在一个反应体系中加入两对及以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤药物基因组学有着重要的应用。基于此，针对KRAS基因的第2号外显子(包含第12、13位密码子)、3号外显子(包含第61号密码子)和BRAF基因的15号外显子(包含第600位密码子)来设计特异性扩增的上下游引物。第一方面，本专利技术提供了用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组，包括：包括下述至少一个用于检测KRAS基因的引物对和用于检测BRAF基因的引物对：用于检测KRAS基因第2号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；用于检测KRAS基因第3号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；用于检测BRAF基因第15号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。通过上述至少一个引物对组成的引物组，可以相对最大程度提高KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子突变的检测通量。具体地，使用上述引物组进行多重PCR扩增反应时，KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子同时在一个扩增体系中进行扩增，即同时扩增包含常见4个突变密码子的基因产物。具体地，当利用上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2来扩增KRAS基因的第2号外显子时，相应扩增产物的片段长度为297bp；当利用上游引物SEQIDNO.3和下游引物SEQIDNO.4来扩增KRAS基因的第3号外显子时，相应扩增产物的片段长度为490bp；当利用上游引物SEQIDNO.5和下游引物SEQIDNO.6来扩增BRAF基因的第15号外显子时，相应扩增产物的片段长度为336bp。如此，利用上述引物组进行多重PCR扩增后，可产生不同长度的DNA片段，以便于后续可电泳分辨不同长度的片段。进而可对不同片段的DNA进行切胶回收，并进行序列的测定。本专利技术还提供了试剂盒，该试剂盒包括SEQIDNO.1至SEQIDNO.6中所示的至少一个引物对。第二方面，基于上述内容，本专利技术提供了一种第一方面所述的用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组的应用方法，包括：设计权利要求1所述的引物组；从待测样本中提取DNA作为扩增模板；配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重聚合酶链式反应PCR反应体系；对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物；根据所述PCR产物，确定所述待测样本的KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子的基因突变情况。在本专利技术一个实施例中，所述根据所述PCR产物，确定所述待测样本的KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子的基因突变情况，包括：电泳检测所述PCR产物，获得所述PCR产物的扩增片段大小；当所述PCR产物的扩增片段大小正确时，对所述PCR产物进行序列测定，获得所述待测样本的KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子的基因突变情况。具体地，由于利用上述引物组进行多重PCR扩增后，可产生不同长度的DNA片段，因此，基于PCR产物的扩增片段大小，即PCR产物的片段长度，确定是否扩增出的PCR产物是否为所需的DNA片段，当扩增出的PCR产物的长度正确时，则可对PCR产物进行测序。具体地，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分辨不同长度的DNA片段。需要说明的是，上述应用方法为非诊断目的的方法。在本专利技术一个实施例中，所述多重PCR反应体系还包括：DNA聚合酶、所述DNA聚合酶对应的PCR缓冲液、4种脱氧核糖核苷三磷酸dNTP的混合物和超纯水。具体地，DNA聚合酶的用量为0.5-5U，以在保证脱氧核苷酸能够加到扩增模板上的同时，避免DNA聚合酶过量造成浪费。具体地，每种dNTP的终浓度为50-500μM，所述引物组中每条引物的终浓度为20-300nM。针对DNA聚合酶的用量来说，0.5-5U是指在0.5U到5U范围内的任一用量值，比如，0.5U、1U、1.5U、2U、2.5U、3U、3.5U、4U、4.5U以及5U。针对每种dNTP的终浓度来说，50-500μM是指50μM到500μM范围内的任一浓度，比如，50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM、450μM以及500μM。针对每条引物的终浓度来说，20-300nM是指20nM到300nM范围内的任一浓度，比如，20nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM以及300nM。具体地，所述DNA聚合酶，包括：Taq聚合酶、KODFX、Phusion或Platinum聚合酶。PCR缓冲液即为与所选的DNA聚合酶相对应的浓缩缓冲液。其中，PCR缓冲液的浓缩程度可选用2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×。在本专利技术一实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组，其特征在于，包括下述至少一个用于检测KRAS基因的引物对和用于检测BRAF基因的引物对：/n用于检测KRAS基因第2号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；/n用于检测KRAS基因第3号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；/n用于检测BRAF基因第15号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组，其特征在于，包括下述至少一个用于检测KRAS基因的引物对和用于检测BRAF基因的引物对：
用于检测KRAS基因第2号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
用于检测KRAS基因第3号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
用于检测BRAF基因第15号外显子的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。


2.一种权利要求1所述的用于检测KRAS基因和BRAF基因突变的引物组的应用方法，其特征在于，包括：
设计权利要求1所述的引物组；
从待测样本中提取DNA作为扩增模板；
配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重聚合酶链式反应PCR反应体系；
对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物；
根据所述PCR产物，确定所述待测样本的KRAS基因的第2、3号外显子和BRAF基因的第15号外显子的基因突变情况。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述根据所述PCR产物，确定所述待测样本...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵方圆，佟洪梅，智慧芳，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11