以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器制造技术

本发明专利技术公开了一种磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器，该电化学传感器由磁性生物复合材料Fe

【技术实现步骤摘要】
以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器
本专利技术属于分析检测
，更具体地，涉及一种以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器及其用于检测癌胚抗原的方法。
技术介绍
癌胚抗原是一种具有人类胚胎抗原特征的酸性糖蛋白，已被确定为一种广谱肿瘤标志物用以指示多种肿瘤的存在和进展，如结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌等。癌胚抗原浓度的增加甚至发生在疾病的临床和放射学症状出现之前，因此，对癌胚抗原的灵敏检测对于癌症的早期临床诊断和预后评估具有重要意义。由于癌胚抗原本身不产生检测信号，对其进行定量检测需要进行信号转换。至今，已被用于检测癌胚抗原的方法有：电化学发光免疫法、化学发光法、表面增强拉曼散射法、比色法、荧光法等等，但是这些检测方法均存在灵敏度低，检测耗时，成本过高以及步骤繁琐的缺点。近年来，癌胚抗原电化学检测方法具有操作简单、检测速度快、成本低、可构建便携设备等优点，因此受到越来越多的关注。但是，目前现有的电化学检测方法检测癌胚抗原存在下述缺点：(1)需要先将电极表面进行复杂的材料修饰，才能够实现对目标物的特异性、灵敏性检测，过程较为复杂，耗时，且成本高；(2)表面修饰过的电极其表面积有限，并且电极的再生过程更加复杂耗时。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器及其用于检测癌胚抗原的方法，本专利技术电化学传感器检测癌胚抗原无需进行电极修饰，能够快速、准确的检测癌胚抗原，对癌胚抗原具有较高的选择性，解决了现有的电化学检测方法需进行复杂的电极修饰、过程繁琐、成本高和电极再生困难的技术问题。本专利技术提供一种磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器，该电化学传感器由磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3在核酸外切酶III辅助下构建得到的；其中，S1为核酸序列，S2为癌胚抗原适配体，S1核酸序列中包含富G序列以及癌胚抗原适配体S2的互补配对序列；S3是富G序列的互补序列。所述磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3的构建方法为：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3。该生物传感器的构建方法为：a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3；b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3中分别加入不同浓度的癌胚抗原分别进行孵育，孵育后分别加入核酸外切酶III再孵育；c)电化学生物传感器的构建：向上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和钾离子，经孵育反应后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将每个含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号，建立标准曲线，构建得到电化学生物传感器。磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，包括如下步骤：a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子(表示为Fe3O4@AuNPs)上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3；其中，S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上的方法为：将修饰有巯基的S1链与Fe3O4@Au纳米粒子在PBS(pH7.4)缓冲液中室温孵育120min。b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3中分别加入不同浓度的癌胚抗原分别进行孵育，孵育后分别加入核酸外切酶III再孵育；c)电化学生物传感器的构建：向上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和钾离子，经孵育反应后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将每个含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号，建立标准曲线，构建得到电化学生物传感器；G-四链体是由S1在钾离子存在的情况下形成的，血红素可插入其中；d)未知浓度样品的检测：将未知浓度的癌胚抗原样品加入磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3中，按上述步骤b)-c)的方法检测，测得未知浓度的癌胚抗原样品的DPV信号，并根据上述标准曲线得到癌胚抗原样品的浓度。其中，S1为核酸序列，S2为癌胚抗原适配体，S1核酸序列中包含富G序列以及癌胚抗原适配体S2的互补配对序列；S3是富G序列的互补序列，当S1,S2和S3互补结合时，核酸外切酶III从S1和S3的3’端开始切割双链。所述的S1中富G序列为23个碱基，与癌胚抗原适配体S2的互补配对序列为15个碱基。更优选地，S1具有SEQIDNO：1所示序列，并且S1序列上修饰有SH-C6，S2具有SEQIDNO：2所示序列，S3具有SEQIDNO：3所示序列，如表1所示。表1步骤a)中，所述Fe3O4@Au纳米粒子是由Fe3O4纳米粒子与HAuCl4制备得到，所述Fe3O4纳米粒子与HAuCl4质量比为1:3～1:7。步骤a)中，所述将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上时，S1在反应体系中的终浓度为0.1-1.0μM，Fe3O4@Au纳米粒子在反应体系中的终浓度为0.2-0.8gL-1；所述修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育时，S1、S2和S3的浓度比为1:1:1；所述共孵育的孵育时间为30-150min，孵育温度为35-40℃。步骤b)中，所述癌胚抗原的浓度范围为0.1-200ngmL-1。优选的，多个癌胚抗原的浓度依次为0，0.1ngmL-1，10ngmL-1，20ngmL-1，60ngmL-1，100ngmL-1，130ngmL-1，170ngmL-1，200ngmL-1。加入不同浓度的癌胚抗原分别进行孵育的孵育条件为:孵育时间为30-90min，孵育温度为20-30℃。步骤b)中，所述加入的核酸外切酶III的终浓度为20-200UmL-1；再孵育时的孵育温度为35-40℃，孵育时间为40-50min。步骤c)中，加入血红素至血红素的终浓度为5-25μM，加入钾离子至钾离子的终浓度为0-100mM；孵育反应的条件为在室温下孵育15-90min；所述测定G-四链体/血红素复合物的DPV信号时电压为-0.7～-0.3V。步骤a)中，所述Fe3O4@Au纳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器，其特征在于，该电化学传感器由磁性生物复合材料Fe

【技术特征摘要】
1.一种以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器，其特征在于，该电化学传感器由磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3在核酸外切酶III辅助下构建得到的；其中，S1为核酸序列，S2为癌胚抗原适配体，S1核酸序列中包含富G序列以及癌胚抗原适配体S2的互补配对序列；S3是富G序列的互补序列。


2.根据权利要求1所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器，其特征在于，所述磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3的构建方法为：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3。


3.根据权利要求1所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器，其特征在于，该电化学传感器的构建方法为：
a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3；
b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3中分别加入不同浓度的癌胚抗原分别进行孵育，孵育后分别加入核酸外切酶III再孵育；
c)电化学生物传感器的构建：向上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和钾离子，经孵育反应后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将各含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定含有不同浓度癌胚抗原的G-四链体/血红素复合物的DPV信号，建立标准曲线，构建得到癌胚抗原电化学传感器。


4.一种权利要求1或3所述的以磁性材料与核酸外切酶III构建的癌胚抗原电化学传感器检测癌胚抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3：先将S1修饰到Fe3O4@Au纳米粒子上，再将修饰有S1的Fe3O4@Au纳米粒子与S2和S3共孵育，构建得到磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3；
b)核酸外切酶III的酶切辅助：向步骤a)构建的磁性生物复合材料Fe3O4@AuNPs-S1-S2-S3中分别加入不同浓度的癌胚抗原分别进行孵育，孵育后分别加入核酸外切酶III再孵育；
c)电化学传感器的构建：向上述再孵育得到的含有不同浓度癌胚抗原的产物中，分别加入血红素和钾离子，经孵育反应后分别得到含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液，将每个含有G-四链体/血红素复合物的混合溶液分别通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定...

【专利技术属性】
技术研发人员：周学敏，朱婉莹，李晓芸，翁晨园，王晶，杨威，卢巧云，严孝强，马瑞文，洪俊丽，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32