本发明专利技术公开了第101位点发生突变的橡胶树EPSPS基因及其检测方法和应用，第101位点发生突变的橡胶树EPSPS基因经转基因验证是草甘膦的抗性基因，主要表现在莽草酸含量提高和种子重量提高；所发生的突变是101位氨基酸由G突变成A，本发明专利技术提供的EPSPS突变基因为揭示植物草甘膦药害机制和转基因检测提供依据；本发明专利技术提供的EPSPS基因点突变的检测方法，可以快速准确经济地分析HbEPSPS基因突变信息，可用于草甘膦靶标HbEPSPS检测和分析。
【技术实现步骤摘要】
第101位点发生突变的橡胶树EPSPS基因及其检测方法和应用
本专利技术涉及农药学和分子生物学领域，具体涉及第101位点发生突变的橡胶树EPSPS基因及其检测方法和应用。
技术介绍
Monsanto公司在1971年开发出广谱灭生性的除草剂草甘膦(Glyphosate)，商品名为农达。草甘膦为灭生性除草剂，是目前应用较广销售量较大的一类有机磷农药，具有高效性与广谱性。因其能有效治理田间单子叶和双子叶、一年生和多年生杂草而被广泛大量使用。田间施药过程中，由于施药不准确和药剂漂移等原因常会造成经济作物药害。草甘膦主要通过抑制植物体内莽草酸途径中5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，阻碍植物合成苯丙氨酸、苏氨酸及酪氨酸，抑制合成植保素等植物次生代谢物，影响植物正常生理生化反应，严重可导致植物死亡。草甘膦作用的关键位点是EPSPS蛋白，研究证明了B.diandrus对草甘膦比野生型植物高出近五倍的遗传抗性是由于EPSPS基因扩增引起的。将EPSPS基因的T-DNA转化导入水稻中产生抗草甘膦水稻。转草甘膦耐受基因G2-EPSPS大豆显示出对草甘膦的高耐受性。通过转入表达密码子修饰的CP4-EPSPS使转基因水稻获得5倍致死剂量的草甘膦抗性。采用定点突变EPSPS中T42M，发现能够增加草甘膦抗性。说明通过筛选EPEPS点突变基因来筛选草甘膦抗性植株是直接有效的。此外，在拟南芥中采用定点突变EPSPS基因的方法使得转基因植株获得抗草甘膦性状。许多高等植物、细菌均含有3个保守结构域，改变其中一点可改变酶的活性和草甘膦的抑制作用。在橡胶树中，发现草甘膦能破坏橡胶树叶片叶绿体结构、导致抗氧化酶活性增加及可溶性糖含量下降。喷施植物逆境脱落酸(ABA)能够显著缓解橡胶树幼苗由草甘膦造成的药害。经检索发现现有技术尚未有橡胶树草甘膦抗性相关的EPSPS点突变技术报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供一个橡胶树5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(HbEPSPS)的突变基因，即第101位点发生突变的橡胶树EPSPS基因，证明转点突变基因拟南芥具有对草甘膦抗性提高功的能；本专利技术的第二目的在于提供一种EPSPS基因的点突变扩增引物；本专利技术的第三目的在于提供一种EPSPS基因点突变的检测方法；本专利技术的第四目的在于提供一种EPSPS点突变转基因植株的构建方法。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：一种EPSPS突变基因，EPSPS基因在101位点的氨基酸由G突变成A，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。EPSPS突变基因在制备用于检测植物样品中草甘膦抗性试剂盒中的应用。进一步地，所述植物为橡胶树或拟南芥。一种EPSPS基因的点突变扩增引物，所述点突变扩增引物为HbEPSPS-G101A-F和HbEPSPS-G101A-R，HbEPSPS-G101A-F的序列如SEQIDNO：6所示，HbEPSPS-G101A-R的序列如SEQIDNO：7所示，具体为：HbEPSPS-G101A-F：5’-TACCGTCTACTTGCCGGCTTCCAAGTCTCT-3’，HbEPSPS-G101A-R：5’-GCCGGCAAGTAGACGGTACCGGAGATTT-3’。一种EPSP基因点突变的检测方法，它包括以下步骤：S1.提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链；S2.以cDNA第一链为模板，HbEPSPS-F和HbEPSPS-R为引物，通过PCR扩增反应获得橡胶树HbEPSPS基因的cDNA序列；进行PCR扩增，PCR仪反应程序如下：94℃预变性3min然后，94℃条件下变性30s，50℃条件下退火50s；72℃条件下延伸2min30s；循环35次，最后72℃延伸10min，4℃保存；其中，所述引物HbEPSPS-F的序列如SEQIDNO：2所示，所述引物HbEPSPS-R的序列如SEQIDNO：3所示，具体为：HbEPSPS-F：5′-TCAGCAGACAAGTTGGTTGG-3′，HbEPSPS-R：5′-ATGGTTGCAGACTTGCAGTG-3′；S3.将通过PCR扩增反应获得的HbEPSPS基因的cDNA片段连接至pMD18-T载体中，并转化大肠杆菌DH5α菌株中进行克隆和测序验证；S4.以cDNA第一链为模板，HbEPSPS-HindIII-F和HbEPSPS-BamHI-R为引物采用PCR技术扩增和产物胶回收；PCR反应程序如下：94℃预变性3min然后，94℃条件下变性30s，50℃条件下退火50s；72℃条件下延伸2min30s；循环35次，最后72℃延伸10min，4℃保存；其中，所述引物HbEPSPS-HindIII-F的序列如SEQIDNO：4所示，所述引物HbEPSPS-BamHI-R的序列如SEQIDNO：5所示，具体为：HbEPSPS-HindIII-F：5′-CCCAAGCTTATGGCTGTTACT-3′(下划线为酶切位点)，HbEPSPS-BamHI-R：5′-CGGGATCCCTCAATCTTACT-3′(下划线为酶切位点)；S5.将步骤S4回收的产物连接到pMD18T载体，转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态；S6.重组子筛选，菌落PCR和测序鉴定。一种EPSPS点突变转基因植株的构建方法，包括以下步骤：S1.提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链；S2.以cDNA第一链为模板，HbEPSPS-F和HbEPSPS-R为引物，通过PCR扩增反应获得橡胶树HbEPSPS基因的cDNA序列，其中，所述引物HbEPSPS-F的序列如SEQIDNO：2所示，所述引物HbEPSPS-R的序列如SEQIDNO：3所示，具体为：HbEPSPS-F：5′-TCAGCAGACAAGTTGGTTGG-3′，HbEPSPS-R：5′-ATGGTTGCAGACTTGCAGTG-3′；S3.将通过PCR扩增反应获得的HbEPSPS基因的cDNA片段连接至pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α菌株中进行克隆和测序验证，测序验证正确的质粒命名为HbEPSPS-18T；S4.以HbEPSPS-18T为模版，采用点突变引物HbEPSPS-G101A-F和HbEPSPS-G101A-R为引物PCR扩增反应获得HbEPSPS基因的cDNA序列，PCR仪反应程序如下：94℃预变性3min然后，94℃条件下变性30s，50℃条件下退火50s；72℃条件下延伸2min30s；循环35次，最后72℃延伸10min，4℃保存。并将其cDNA片段连接至pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α菌株中进行克隆和测序验证，测序验证正确的质粒命名为HbEPSPS-G101A-18T；其中，所述点突变引物HbEPSPS-G101A-F的序列如SEQIDNO：6所示，所述点突本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种EPSPS突变基因，其特征在于EPSPS基因在101位点的氨基酸由G突变成A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种EPSPS突变基因，其特征在于EPSPS基因在101位点的氨基酸由G突变成A，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
2.权利要求1所述EPSPS突变基因在制备用于检测植物样品中草甘膦抗性试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物为橡胶树或拟南芥。
4.一种EPSPS基因的点突变扩增引物，其特征在于，所述点突变扩增引物为HbEPSPS-G101A-F和HbEPSPS-G101A-R，HbEPSPS-G101A-F的序列如SEQIDNO：6所示，HbEPSPS-G101A-R的序列如SEQIDNO：7所示。
5.一种EPSP基因点突变的检测方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1.提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链；
S2.以cDNA第一链为模板，HbEPSPS-F和HbEPSPS-R为引物，通过PCR扩增反应获得橡胶树HbEPSPS基因的cDNA序列；
其中，所述引物HbEPSPS-F的序列如SEQIDNO：2所示，所述引物HbEPSPS-R的序列如SEQIDNO：3所示；
S3.将通过PCR扩增反应获得的HbEPSPS基因的cDNA片段连接至pMD18-T载体中，并转化大肠杆菌DH5α菌株中进行克隆和测序验证；
S4.以cDNA第一链为模板，HbEPSPS-HindIII-F和HbEPSPS-BamHI-R为引物采用PCR技术扩增和产物胶回收；
其中，所述引物HbEPSPS-HindIII-F的序列如SEQIDNO：4所示，所述引物HbEPSPS-BamHI-R的序列如SEQIDNO：5所示；
S5.将步骤S4回收的产物连接到pMD18T载体，转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态；
S6.重组子筛选，菌落PCR和测序鉴定。
6.一种EPSPS点突变转基因植株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提...
【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，王萌，李晓娜，肖厚贞，张冬，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南;46
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