组织样品制备系统技术方案

本发明专利技术涉及一种制备光学分析用生物组织样品(301)，从而所制备样品的体积和/或形态距原始组织的体积或形态的偏离最小化的方法(100)。该方法包括：－a)用第一固定液(202)固定(102)组织样品；－b)在脱脂液(204)中浸渍(104)组织样品，所述脱脂液包含适应于诱导样品膨胀的离液剂；－d)着染(108)组织样品；－f)在有机脱水液(210)中使组织样品脱水(112)，脱水液适应于诱导样品收缩；和－g)在有机透明化液(212)中浸渍(114)固定的组织样品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】组织样品制备系统
本专利技术涉及制备光学分析用生物组织样品，并且更具体地涉及组织透明化方案(tissueclearingprotocols)。背景和相关技术组织样品的化学透明化正日益变成用于检测和重建组织样品(包括完整器官)中结构的关键手段。为了显微分析，一些组织类型薄到足以直接观察。大部分组织(例如，活检样品、厚组织样品、复杂3D组织形成如类器官或类球体、小型成年哺乳动物(如小鼠)的完整器官或完整躯体或胚胎)太厚，以至于不允许光穿过其传播。将组织切成薄切片具有丢失生物医学重要信息的缺点：生物学结构内在地是三维的(3D)。几种显微技术同时可用于(例如共聚焦显微术、双光子显微术和光片显微术)获得组织的3D图像。但是，生物标本天然地对UV-VIS-NIR范围的光学光不透明。通常，这种不透明度的主要来源是吸收和散射。实际上，生物组织样品最终由浸渍于低折射介质(水)中的各种高折射率大分子如脂质和蛋白质构成。在生物分子的高折射率和包含这些分子的胞内水及胞外水的低折射率之间的错配产生多重散射事件，最终导致不透明的样品。光学光子已经在组织中短距离行进后，这些多重散射事件导致数目高度减少的光学光子在直路径上穿过组织行进(所谓弹道光子(ballisticphotons))。越多光子在其穿过组织的道路上散射，则组织变得越不透明。但是，即便完全不存在散射，总吸收也常导致完全不透明(非透明)的组织样品。因此，为了用显微镜检查，其尺寸超过某个阈值的标本必须“透明化”，而如本文所用的“透明化(clearing)”是如此处理生物样品，从而减少穿过样品的光的散射，例如，通过降低生物分子和周围介质之间的折射率错配做到。如今常用的(如果并不是大部分的话)许多透明化技术基于使用有机溶剂。基于有机溶剂的透明化方法如例如uDISCO依赖于用显示折射率(RI)约1.55(即，许多组织类型的常见RI)的有机溶剂置换组织水。例如，使用苯甲醇和苯甲酸苄酯(BABB)的混合物作为有机溶剂。由于苯甲酸苄酯不溶于水中，常用基于丁醇的中间脱水步骤。这种通用方案(用有机溶剂脱水，然后在高折射率有机溶剂中孵育)是高度流行的透明化技术，但是具有几个缺点：在短时间段后，它使可能已经包含于组织中的荧光蛋白的发射猝灭，并且可以造成组织样品的明显收缩和形态变化。例如，WeizheLi,RonaldN.Germain和MichaelY.Gerner，“大组织体积中采用透明化增强型3D显微术(Ce3D)的多重、定量细胞分析(Multiplex,quantitativecellularanalysisinlargetissuevolumeswithclearing-enhanced3Dmicroscopy(Ce3D))”,PNAS2017114(35)E7321-E7330显示，CUBIC方案和iDISCO方案不利地影响组织样品形态。专利技术概述本专利技术的目的是提供制备光学分析用生物组织样品的改进方法、用于制备生物样品的相应系统和试剂盒，如独立权利要求中具体所述。本专利技术的实施方案在从属权利要求中给出。除非本文所述的实施方案和实施例不互斥，否则它们可以彼此自由组合。在一个方面，本专利技术涉及一种制备光学分析用生物组织样品的方法。特别地，如此制备生物组织样品，从而所制备样品的体积和/或形态距原始组织的体积或形态的偏离减少或最小化。该方法包括：-a)用第一固定液固定组织样品；-b)在脱脂液中浸渍固定的组织样品，脱脂液包含适应于诱导样品膨胀的离液剂；-d)用一种或多种染色液着染组织样品；-f)在有机脱水液中洗涤和脱水染色的组织样品，脱水液适应于诱导样品收缩；-g)在有机透明化液中浸渍固定的组织样品。根据一些实施方案，至少洗涤和脱水步骤可以包括多个子步骤，例如在有机溶剂浓度渐增的一系列脱水液中使样品脱水。在有机透明化方案背景下，在具有离液剂的脱脂液中浸渍固定的组织样品可能是有利的，因为它可以允许生成具有高光学透明度的组织样品，其体积与最初所来源自的源生物的组织样品的体积相同或至少高度相似。如果欲光学地分析透明化样品以重建原始组织样品的形状和形态，这是特别有益的。在现有技术中，存在不诱导组织样品收缩的基于水的透明化方案。相反地，通常认为基于有机透明化液的现有透明化方案为组织提供更高程度的光学透明度，但一般引起样品强烈收缩。因此，本专利技术的实施方案可以允许在不明显程度地改变组织样品的体积和/或形态情况下，使用有机透明化液制备组织样品供进一步光学分析。因此，本专利技术的实施方案可以允许基于透明化组织样品的光学分析，忠实对组织的原始3D形态成像或重建，甚至对于大的组织样品和甚至对于已经观察到响应于有机溶剂置换组织水发生强烈收缩的组织类型(例如脑组织)亦是如此。使用离液剂可能是有利的，因为离液剂使蛋白质和膜去稳定化，例如通过使蛋白质解折叠、使疏水性聚集物去稳定化和增加疏水物的溶解度。离液剂造成组织样品膨胀。根据实施方案，具有离液剂的脱脂液造成组织样品膨胀至少5％、特别地至少10％，并且特别地以适应于补偿有机透明化剂所带来收缩的量膨胀。已经令人惊讶地观察到，由有机溶剂和有机脱水液诱导的组织收缩和由离液剂引起的组织膨胀具有组织类型依赖性。肌肉和肝组织中可观察到明显的膨胀以及收缩作用，但是可观察的膨胀以及收缩作用在脑组织中突出得多。已经观察到，使用具有5-30％和特别地15％-25％之间浓度范围的离液剂的脱脂液诱导膨胀作用，所述膨胀作用将在宽范围的组织类型中(事先)补偿有机脱水液引起的收缩。在又一有益方面，离液剂可能是有利的，因为离液剂将通过移除脂质，特别地来自组织的膜脂质，增加组织透明度，因而增加最终获得的透明化组织样品的组织透明度。本专利技术的实施方案可以借助简单、快速和不太费力的浸渍方案，允许甚至大的组织样品(例如，任何鼠器官)的光学透明化，所述浸渍方案可以确保组织样品的体积和/或形态保留。费力工作(如清除血液的穿心灌注)和使用加速透明化或染色技术的专业化装置可能淘汰。可以迅速地、可再现地和任选地按半自动化或全自动化方式处理来自动物研究中庞大队列或来自临床诊断学背景下患者的众多样品。另外，实现了允许通过光片显微镜(例如3D光片显微镜)以细胞分辨率测量组织的透明度。由于改进地保留了原始形态且光散射明显减少以及信噪比增加，借助本专利技术实施方案的样品制备方法，生成的样品可以在短时间内测量并且以更好的准确度三维可视化。例如，根据一些实施方案，肿瘤中或肿瘤微环境中或肿瘤学(和其他疾病)小鼠模型的其他器官或组织中或患者组织样品中的免疫细胞群体可以可视化并且三维地共定位及定量。通过同时标记血管结构(例如通过体内施用荧光标记的凝集素)和形态的可视化，可以深层分析临床前研究中治疗药对已标记细胞群体的影响。例如，该方法可以用于加工人(例如，临床诊断学背景下的患者)的组织样品。可能不需要着染血管来可视化肿瘤微环境中的某些细胞类型或研究药物例如对免疫细胞参与或活性的影响。但是，为了研究药物在样品中的生物学分布(例如通过使用荧光标记的治疗性化合物)或如果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备光学分析用生物组织样品(301)，从而所制备样品的体积和/或形态距原始组织的体积或形态的偏离最小化的方法(100)，所述方法包括：/n-a)用第一固定液(202)固定(102)组织样品；/n-b)在脱脂液(204)中浸渍(104)固定的组织样品，脱脂液包含适应于诱导样品膨胀的离液剂；/n-d)用一种或多种染色液(206)着染(108)组织样品；/n-f)在有机脱水液(210)中使染色的组织样品脱水(112)，脱水液适应于诱导样品收缩；和/n-g)在有机透明化液(212)中浸渍(114)固定的组织样品。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171229 EP 17211233.61.一种制备光学分析用生物组织样品(301)，从而所制备样品的体积和/或形态距原始组织的体积或形态的偏离最小化的方法(100)，所述方法包括：
-a)用第一固定液(202)固定(102)组织样品；
-b)在脱脂液(204)中浸渍(104)固定的组织样品，脱脂液包含适应于诱导样品膨胀的离液剂；
-d)用一种或多种染色液(206)着染(108)组织样品；
-f)在有机脱水液(210)中使染色的组织样品脱水(112)，脱水液适应于诱导样品收缩；和
-g)在有机透明化液(212)中浸渍(114)固定的组织样品。


2.根据权利要求1所述的方法，还包括：
-c)用波长范围的光照射样品，其中所述波长范围包含染料的一个或多个发射波长和/或激发波长，以选择性消除或减少样品在所述波长范围内的自身荧光。


3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：
-e)在进行洗涤和脱水之前，用第二固定液(208)固定(110)染色的组织样品。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如此选择脱脂液的组成，从而有机脱水液诱导的组织收缩事先被脱脂液诱导的膨胀补偿。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，
-其中离液剂是适应于引起样品的体积膨胀至少15％的原始样品体积或至少20％的原始样品体积；和/或
-其中如此选择脱脂液的组成，从而脱脂液诱导的膨胀和脱水液引起的收缩的联合效果提供与原始、未处理组织样品的体积偏离小于15％、优选地小于10％、优选地小于5％的透明化组织样品。


6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，离液剂是非离子型离液剂、特别地脲或硫脲、或离子型离液剂胍、特别地以胍盐形式提供的胍。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中脱脂液包含以体积计5-30％、优选地10-25％、优选地15-25％、更优选地20-25％的氨基醇、特别地N,N,N',N'-四(2-羟丙基)乙二胺。


8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中脱脂液是基于水的透明化液。


9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中组织在第一固定组合物中的固定、固定的组织样品在脱脂液中的浸渍、染色、脱水、和固定的组织样品在有机透明化液中的浸渍以自动化或半自动化工艺进行，所述工艺不包括灌注步骤。


10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，有机透明化液是苯甲醇和苯甲酸苄酯(BABB)的混合物，所述方法包括：
-制备有机透明化液，所述制备包括如此选择苯甲醇和苯甲酸苄酯的比率，从而有机透明化液的折射率与样品的组织类型的折射率相同或相似。
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【专利技术属性】
技术研发人员：M·多布斯，J·穆勒，T·波辛格，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH