6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备万古霉素检测试剂中的用途制造技术

本申请涉及6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备万古霉素检测试剂中的用途。具体而言，本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型6‑磷酸葡萄糖脱氢酶包含选自以下的一个突变或其组合：D306C、D375C、G426C。使用本申请的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体所制备的检测试剂盒，其特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量检测。

【技术实现步骤摘要】
6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备万古霉素检测试剂中的用途本申请要求2019年1月9日提交的201910017764.4和2019年5月21日提交的201910423122.4《6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途》的优先权，其通过引用并入此处。
本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在万古霉素检测试剂盒中的应用。
技术介绍
半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。万古霉素(Vancomycin)结构式如下所示：万古霉素分子量为1485.71，为窄谱抗生素，仅对革兰阳性菌有效(如溶血性链球菌、肺炎球菌及肠球菌等)，对耐药金葡菌本品尤为敏感。万古霉素的作用机制是抑制细菌细胞壁的合成，它主要和细菌细胞壁结合，而使某些氨基酸不能进入细胞壁的糖肽中。临床主要用于耐青霉素金葡菌所引起的严重感染，如肺炎、心内膜炎及败血症等，对溶血性链球菌引起的感染及败血症等也有较好的疗效。万古霉素还可以用于治疗结肠炎和肠道炎症；万古霉素还经常用于安装心脏导管、静脉导管等装置时的预防感染。万古霉素可以单独用药，也可以联合用药。万古霉素与其他抗生素无交叉耐药性，极少耐药菌株。主要用于心内膜炎、败血症、伪膜性肠炎等。万古霉素口服不吸收，单剂静脉滴注400mg，滴注完毕即达到血药峰浓度25.18mg/L，8小时血浓度平均为1.90mg/L，有效血浓度可维持6至8小时。单次静脉滴注800mg，高峰血浓度平均为50.07mg/L。静脉滴注后，主要经肾脏排泄，单次静滴400mg，24小时尿中平均总排泄率为81.1％；单次静滴800mg，24小时尿中平均总排泄率为85.9％。目前已知的万古霉素检测方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)、发光免疫、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)等方法。HPLC法需要复杂的样品前处理，操作复杂周期长且成本昂贵；发光免疫法试剂成本昂贵，不适合常规治疗药物检测，更不利于大范围推广。现有的均相酶免疫测定法、胶乳凝集比浊法常常因制备工艺复杂、批间差大，应用受到一定限制。现有技术CN108717117A描述了一种万古霉素检测试剂盒。然而，现有技术的方法依赖于对小分子药物(万古霉素)自身所带反应基团进行的激活，之后再与酶进行反应。这样的偶联方法会出现同一葡萄糖六磷酸脱氢酶上链接有多个万古霉素的情况，且偶联位点难以确保一致性，难以保证小分子药物和酶之间的定向1：1反应，而导致批间差异大。
技术实现思路
鉴于本领域的需求，本申请提供了一种新型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备万古霉素检测试剂盒中的用途。根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。区别于已有发表的专利US006090567A(Homogeneousimmunoassaysusingmutantglucose-6-phosphatedehydrogenases)的6磷酸葡萄糖脱氢酶的突变体，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变：D306C、G426C、D375C。根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4。根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸。根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：n偶联而成。在一些实施方案中，n是1至50，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50。在一些具体的实施方案中，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比优选为1：1。在一些具体的实施方案中，半抗原的分子量为100Da至4000Da，例如：100、150、200、250、300、350、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、550、570、600、620、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000。根据本申请，技术人员将理解，“半抗原”还包含其衍生物的形式。为了便于和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进行偶联，对于那些自身不带有偶联基团(例如，与巯基反应的基团)的半抗原(例如万古霉素)，可以经改造而带有接头，以便和巯基共价结合。因此，在本申请中，半抗原衍生物是指，经改造而带有巯基反应基团的半抗原。半抗原选自：小分子药物(如抗生素、精神药物)、激素、代谢物、糖、脂质、氨基酸。半抗原例如但不限于：万古霉素、茶碱、苯妥英、维生素D、25羟维生素D、1，25双羟维生素D、叶酸、强心甙(包括洋地黄毒苷)、酶酚酸、雷帕明、环胞菌素A、乙胺碘复酮、甲胺喋呤、他克莫司、血清氨基酸、胆汁酸、甘胆酸、苯丙氨酸、乙醇、尿尼柯丁代谢产物柯替宁、尿吗啡、尿单羟酚衍生物、神经肽酪氨酸、血浆甘丙素、多胺、组织胺、促甲状腺激素、泌乳素、胎盘泌乳素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种偶联物，其是6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：1偶联而成；/n所述半抗原是万古霉素或其衍生物；/n优选，所述万古霉素衍生物是式I所示：/n

【技术特征摘要】
20190109 CN 2019100177644;20190521 CN 2019104231221.一种偶联物，其是6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：1偶联而成；
所述半抗原是万古霉素或其衍生物；
优选，所述万古霉素衍生物是式I所示：



其中，



m为1至10的整数，优选1至5的整数。


2.根据权利要求1所述的偶联物，其中：
所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，相较于野生型6-磷酸葡萄糖脱氢酶，包含选自以下的一个突变：D306C、D375C、G426C；
优选地，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4。


3.一种试剂，其包含权利要求1或2所述的偶联物。


4.权利要求1或2所述的偶联物在制备检测试剂中的用途，其中：
所述检测试剂是万古霉素的检测试剂；
优选地，所述检测试剂选自：酶联免疫法检测试剂、化学发光免疫法检测试剂、均相酶免疫法检测试剂、胶乳增强免疫比浊法检测试剂。


5.权利要求1或2所述的偶联物在制备检测装置中的用途：
所述检测装置是针对万古霉素的检测装置；
所述检测装置选自以下任一的形式：孔板、颗粒、芯片、试纸；
优选地，所述检测装置用于万古霉素的均相免疫检测。


6.一种万古霉素检测试剂盒，其包含：
第一试剂，所述第一试剂包含底物、万古霉素抗体、缓冲液；
第二试剂，所述第二试剂包含权利要求1或2所述的偶联物、缓冲液；
任选地，校准品，所述校准品包含10mM至500mM缓冲液、0μg/ml至100μg/ml万古霉素；以及
任选地，质控品，所述质控品包含10mM至500mM缓冲液、2μg/ml至60μg/ml万古霉素。


7.根据权利要求6所述的万古霉素检测试剂盒，其包含：
第一试剂，其包含：
10mM至500mM，优选50mM至300mM缓冲液、
5mM至50mM，优选10mM至20mM葡萄糖-6-磷酸、
5mM至50mM，优选10mM至20mM氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、
0.5mg/L至5.0mg/L，优选1.0mg/L至3.0mg/L抗苯巴比妥抗体、
0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L稳定剂、
0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L表面活性剂、
0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L防腐剂；
第二试剂，其包含：
10mM至500mM，优选50mM至300mM缓冲液、
10ng/mL至500ng/mL，优选50ng/mL至200ng/mL权利要求1或2所述的偶联物、
0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L稳定剂、
0.1g/L至5g/L，优选1g/L至5g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：张启飞，金石，龚俊，王贵利，封建新，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11