本发明专利技术公开了一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，包括以下步骤：获取浮萍植株，剪取浮萍植株的假根，放入甘露醇溶液并于27‑29℃处理28‑30min，用组织酶解液在黑暗、25‑26℃条件下酶解浮萍植株的假根25‑30min，得到原生质体，用A液清洗所述原生质体2～3次，琼脂糖包埋原生质体，原生质体的裂解，单细胞凝胶电泳，染色及观察，在荧光显微镜下观察原生质体的彗星图像，当出现彗星拖尾现象判断为该原生质体DNA受损。本发明专利技术的方法首创了利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度，利用该方法可在短时间内检测浮萍原生质体DNA损伤程度。
【技术实现步骤摘要】
利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法本专利技术得到：国家自然科学基金青年项目(31700443)的资助。天津师范大学2018年市级创新训练项目(201810065031)。
本专利技术属于单细胞凝胶电泳
，具体来说涉及一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法。
技术介绍
单细胞凝胶电泳(singlecellgelelectrophoresis,SCGE)又称彗星试验(cometassay)是近年来发展起来的可以在细胞水平检测真核细胞DNA损伤的一种遗传毒理分析技术,具有简便、快速、灵敏、样品用量少和无需放射性标记等特点。目前运用单细胞凝胶电泳技术检测动物或人细胞DNA损伤的研究国际上已有一些报道，但应用于植物细胞DNA损伤研究的尚不多见。若以动物或人体细胞为原材料进行单细胞凝胶电泳，其培养技术相对复杂，来源少、成本高；制备单个细胞时多数需要经过酶解或细胞剪切、匀浆，不可避免的对细胞造成一些伤害，而且所获细胞来源、尺寸不同，可能会影响结果的判断。另一方面，以往的以植物细胞为材料进行电泳，获得的彗星图像效率均不高。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，该方法通过一定的方法处理使植物细胞质壁分离、降解细胞壁获取原生质体，进行悬浮培养，无酶学消化作用，具有快速、简便、成本低廉、结果准确等优点，有效的获取的浮萍原生质体进行单细胞凝胶电泳的彗星图像。本专利技术以单细胞凝胶电泳技术为手段检测萍原生质体DNA损伤程度，可用于探索重金属镉对植物遗传毒理效应的检测方法和实验体系，并为研究植物相应重金属胁迫的细胞和分子机理提供新的证据。本专利技术的目的是通过下述技术方案予以实现的。一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍(Lemnaturionifera)原生质体DNA损伤程度的方法，包括以下步骤：1)获取浮萍植株；2)剪取步骤1)所得浮萍植株的假根，放入甘露醇溶液并于27-29℃处理28-30min，以使浮萍发生质壁分离，其中，所述甘露醇溶液中甘露醇的浓度为130g/L-150g/L；在所述步骤2)中，所述假根的长度为2-5cm。3)用组织酶解液在黑暗、25-26℃条件下酶解步骤2)所得浮萍植株的假根25-30min，得到原生质体，用A液清洗所述原生质体2～3次，其中，在酶解过程中，每隔8-10min吹打混匀一次，以使原生质体悬浮；所述组织酶解液的组成包括：在所述步骤3)中，每次清洗所述原生质体的方法为：用A液垂直打入离心管，以使原生质体自动悬起，悬浮后进行离心，离心后移除上层清液，其中，离心的温度为20-25℃，转速为2000-3000×g，时间为2-5min。4)琼脂糖包埋原生质体：在载玻片上滴加150-200μL正常熔点琼脂糖凝胶制备第一层胶，加盖盖玻片，在室温20～25℃保持至少10小时，以使正常熔点琼脂糖凝胶干燥，移除所述盖玻片；将60-70μL低熔点琼脂糖凝胶与30-40μL步骤3)所得原生质体混合，滴加在所述第一层胶上，再次加盖盖玻片，于4℃固化10-20min；在所述步骤4)中，所述低熔点琼脂糖凝胶由低熔点琼脂糖与去离子水组成，低熔点琼脂糖凝胶中低熔点琼脂糖的质量分数为0.8～1％。在所述步骤4)中，所述正常熔点琼脂糖凝胶由正常熔点琼脂糖和去离子水组成，正常熔点琼脂糖凝胶中正常熔点琼脂糖的质量分数为0.8～1％。在所述步骤4)中，正常熔点琼脂糖的熔点为87-92℃；低熔点琼脂糖的熔点为62-68℃。5)原生质体的裂解：用PBS缓冲液浸泡纱布，直至纱布完全湿透，移去步骤4)所得载玻片的盖玻片，用所述纱布包裹载玻片，将包裹有纱布的载玻片移入碱性裂解液中，在4℃裂解55-65min，其中，将载玻片移入碱性裂解液前，所述碱性裂解液在4℃放置至少2h，PBS缓冲液的组成包括：K2HPO4·3H2O11-12g/lKH2PO46-8g/l溶剂为去离子水所述碱性裂解液的组成包括：NaCL146-146.5g/lNa2EDTA37-37.5g/lTris(三羟甲基氨基甲烷)1-1.5g/l溶剂为去离子水其中，所述碱性裂解液在4℃放置至少2h前加入该碱性裂解液质量10-11wt％的DMSO(二甲基亚砜)和1-2wt％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)并均匀混合；在所述步骤5)中，所述碱性裂解液的pH为9.8-10.2。在所述步骤5)中，所述PBS缓冲液的pH为7.3-7.5。6)单细胞凝胶电泳：用PBS缓冲液漂洗步骤5)所得载玻片3-5次，置于水平电泳槽内，加入Ph为13-15的电泳缓冲液，在黑暗、4℃条件下孵育28-35min后进行电泳，电泳条件如下：电压为20-25V，电流为300-350mA，电泳时间为30-35min；在所述步骤6)中，电泳缓冲液的组成包括：Na2EDTA0.35-0.4g/lNaOH1-1.5g/l溶剂为去离子水7)染色及观察：从水平电泳槽中取出载玻片，用PBS缓冲液漂洗3-5次，每次3-5min，漂洗后用SYBRGold对所述原生质体染色；在所述步骤7)中，染色后将载玻片浸泡在PBS缓冲液中，用于洗掉多余的染料。8)在荧光显微镜下观察步骤7)得到原生质体的彗星图像，当出现彗星拖尾现象判断为该原生质体DNA受损。本专利技术的方法首创了利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度，利用该方法可在短时间内检测浮萍原生质体DNA损伤程度，应用于浮萍经重金属镉胁迫后原生质体DNA损伤和修复的研究，填补了检测植物细胞DNA损伤程度的方法的空白。该方法取材少，耗时短，操作简单方便，检测结果准确可靠。浮萍对重金属镉胁迫较敏感，可以根据浮萍原生质体DNA损伤程度探索重金属镉对植物遗传毒理效应的检测方法和实验体系，并未研究植物相应重金属胁迫的细胞和分子机理提供新的证据。附图说明图1为未经CdCl2处理的浮萍原生质体电泳图；图2为经CdCl2处理的浮萍原生质体电泳图(实施例1)；图3为经CdCl2处理的浮萍原生质体电泳图(实施例2)；图4为经CdCl2处理的浮萍原生质体电泳图(实施例3)。具体实施方式在本专利技术的实施例中，浮萍(Lemnaturionifera)采集自天津市西青区湖水中。为了验证本专利技术检测的结果，步骤1)中浮萍植株为经重金属镉胁迫后的浮萍植株，经重金属镉胁迫后的浮萍植株的获取方法为：配置含镉离子的Datko培养基，将浮萍培养于含镉离子的Datko培养基上，得到浮萍植株，其中，培养温度为23℃，培养时间24h，光照周期16小时/天，光强95μmolm-2s-1，其中，Datko培养基中镉离子的浓度为50μM。Datko培养基获取方法：在每3mL的D本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)获取浮萍植株；/n2)剪取步骤1)所得浮萍植株的假根，放入甘露醇溶液并于27-29℃处理28-30min，以使浮萍发生质壁分离，其中，所述甘露醇溶液中甘露醇的浓度为130g/L-150g/L；/n3)用组织酶解液在黑暗、25-26℃条件下酶解步骤2)所得浮萍植株的假根25-30min，得到原生质体，用A液清洗所述原生质体2～3次，其中，在酶解过程中，每隔8-10min吹打混匀一次，以使原生质体悬浮；所述组织酶解液的组成包括：/n
【技术特征摘要】
1.一种利用单细胞凝胶电泳技术检测浮萍原生质体DNA损伤程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获取浮萍植株；
2)剪取步骤1)所得浮萍植株的假根，放入甘露醇溶液并于27-29℃处理28-30min，以使浮萍发生质壁分离，其中，所述甘露醇溶液中甘露醇的浓度为130g/L-150g/L；
3)用组织酶解液在黑暗、25-26℃条件下酶解步骤2)所得浮萍植株的假根25-30min，得到原生质体，用A液清洗所述原生质体2～3次，其中，在酶解过程中，每隔8-10min吹打混匀一次，以使原生质体悬浮；所述组织酶解液的组成包括：
4)琼脂糖包埋原生质体：在载玻片上滴加150-200μL正常熔点琼脂糖凝胶制备第一层胶，加盖盖玻片，在室温20～25℃保持至少10小时，以使正常熔点琼脂糖凝胶干燥，移除所述盖玻片；将60-70μL低熔点琼脂糖凝胶与30-40μL步骤3)所得原生质体混合，滴加在所述第一层胶上，再次加盖盖玻片，于4℃固化10-20min；
5)原生质体的裂解：用PBS缓冲液浸泡纱布，直至纱布完全湿透，移去步骤4)所得载玻片的盖玻片，用所述纱布包裹载玻片，将包裹有纱布的载玻片移入碱性裂解液中，在4℃裂解55-65min，其中，将载玻片移入碱性裂解液前，所述碱性裂解液在4℃放置至少2h，PBS缓冲液的组成包括：
K2HPO4·3H2O11-12g/l
KH2PO46-8g/l
溶剂为去离子水
所述碱性裂解液的组成包括：
NaCL146-146.5g/l
Na2EDTA37-37.5g/l
Tris(三羟甲基氨基甲烷)1-1.5g/l
溶剂为去离子水
其中，所述碱性裂解液在4℃放置至少2h前加入该碱性裂解液质量10-11wt％的DMSO(二甲基亚砜)和1-2wt％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)并均匀混合；
6)单细胞凝胶电泳：用PBS缓冲液漂洗步骤5)所得载玻片3-5次，置于水平电泳槽内，加入Ph为13-15的电泳缓冲液，在黑暗、4℃条件下孵育28-35min后进行电泳，电泳条件如下...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨琳，王苏桐，韩玉洁，魏莹，李娜，曾键尧，王华忠，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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