用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术属于基因检测技术领域，特别涉及一种用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒，将多重PCR和基于毛细管电泳技术的遗传分析系统相结合，在一个PCR反应系统中同时完成JAK2V617F与CALR第九外显子基因突变检测；采用毛细管电泳片段分析法分析PCR产物片段由于具有高分辨率，因此即使出现非特异扩增也能识别，而传统手段只能在特定片段大小位点出现荧光信号才可判读为阳性；具有高灵敏度，可识别最低0.1ng/uL DNA中的突变，以及最少0.1％的突变；通量高，使用该方法可同时分析96个标本的基因突变情况，可应用于大规模疾病筛查。

【技术实现步骤摘要】
用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒
本专利技术属于基因检测
，特别涉及一种用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒。
技术介绍
BCR-ABL阴性的骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferativeneoplasms，MPN)真性红细胞增多症(polycythemiavera，PV)、原发性血小板增多症(essentialthrombocythemia，ET)和原发性骨髓纤维化(primarymyelofibrosis，PMF)等疾病。此类疾病主要是因为人体正常基因发生突变而造成骨髓细胞一系或多系增生活跃。因此发现及检测基因突变成为MPN的主要诊断方法。近年来的研究表明在MPN患者中主要存在JAK2(Januskinase2)、CALR(calreticulin)、MPL(myeloproliferativeleukemiavirusgene)等基因的突变，JAK2、CALR以及MPL基因突变已成为诊断MPN的主要标准。其中JAK2V617F突变在PV中阳性率可高达95％，在ET与PMF中的突变率达50％以上，同时20％-30％的ET和PMF患者中存在CALR基因第九外显子的缺失(CALRL367fs*46，52bp缺失)或者插入(CALRL385fs*47，5bp插入)突变，因此对JAK2V617F以及CALR第九外显子基因突变检测对诊断MPN具有非常重要的意义。检测JAK2V617F以及CALR基因突变的方法主要有荧光定量PCR法、高分辨熔解曲线法、直接测序法等。以上方法在检测MPN基因突变的应用已经在文献中相继报道，检测技术相对成熟且已经有商品化试剂盒供临床诊断使用。由于JAK2V617F是点突变，可以使用突变扩增系统PCR(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS-PCR)通过PCR和琼脂糖凝胶电泳或者实时荧光PCR即可检测出DNA中已知突变，但是CALR第九外显子的突变多属于小片段的缺失和插入突变，普通的琼脂糖凝胶电泳由于对扩增产物的分辨力有限，无法精确分辨出CALR基因突变，需要对PCR产物进一步的进行基因测序准确分析。使用普通的凝胶电泳分析，无法在同一个PCR反应管中同时检测JAK2V617F、CALR基因突变。实时荧光PCR检测多基因突变时，每个突变位点都要设计特异性荧光探针，且同一标本需要进行多管PCR反应，时间与经济成本相对较高。基于多重PCR技术和基于毛细管电泳技术的遗传分析系统片段分析功能进行多基因检测已经广发应用于微生物病原检测、基因表达分析等分子检测领域。但是使用基于毛细管电泳技术的遗传分析系统片段分析功能同时检测JAK2V617F及CALR第九外显子的缺失或者插入突变的相关报道国内外还未见。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组及试剂盒，将多重PCR和基于毛细管电泳技术的遗传分析系统相结合，在一个PCR反应系统中同时完成JAK2V617F与CALR第九外显子基因突变检测，以期可以开发出一种快速、便捷诊断MPN疾病基因突变的检测试剂盒。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：本专利技术所述的用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组，其特征在于：包括用于JAK2V617F基因突变的ARMS引物和用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物；其中，所述用于JAK2V617F基因突变的ARMS引物包括SEQIDNO：1所示的JAK2野生型正向引物、SEQIDNO：2所示的JAK2突变型反向引物、SEQIDNO：3所示的JAK2内参正向引物和SEQIDNO：4所示的JAK2内参反向引物，所述用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物包括SEQIDNO：5所示的CALR正向引物和SEQIDNO：6所示的CALR反向引物。其中，优选方案如下：所述的用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的引物组，其特征在于：所述JAK2野生型正向引物、JAK2内参正向引物和CALR正向引物的5'标记的荧光基团为CY5。本专利技术还提供了一种用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR试剂盒，其特征在于：含有2×rTaq的PCR反应液10uL、上文所述的JAK2野生型正向引物、JAK2突变型反向引物、JAK2内参正向引物、JAK2内参反向引物、CALR正向引物和CALR反向引物各0.5uL、待测DNA模板1uL、ddH2O6uL，其中各引物的浓度均为10uM。其中，优选方案如下：所述待测DNA模板的浓度为10～200ng/uL。该PCR试剂盒的PCR扩增反应的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共40个循环；72℃充分延伸5min。该PCR试剂盒的PCR扩增产物的分析方法采用毛细管电泳法，具体按照以下步骤进行：1)在96孔加样板的每孔中加入30uL上样缓冲液(美国BECKMAN公司，货号：608012)、分子内标1uL(美国BECKMAN公司，货号：608098)、1uLPCR扩增产物，并加盖石蜡油；2)在分离液缓冲板中加入分离液并关注聚丙烯酰胺凝胶；3)将96孔加样板和分离液缓冲板放入遗传分析系统(美国BECKMANGenomeLabGeXP遗传分析系统)，选择毛细管电泳程序进行检测，具体程序如下：90℃变性时间120s,注射电压2.0KV时间30s，分离电压6.0KV时间45min；根据电泳条带大小分析结果。本专利技术的优点在于：(1)使用多重PCR在一个PCR反应管中可同时检测两个基因三个位点的突变情况；(2)采用毛细管电泳片段分析法分析PCR产物片段由于具有高分辨率，因此即使出现非特异扩增也能识别，而传统手段只能在特定片段大小位点出现荧光信号才可判读为阳性；(3)具有高灵敏度，可识别最低0.1ng/uLDNA中的突变，以及最少0.1％的突变；(4)通量高，使用该方法可同时分析96个标本的基因突变情况，可应用于大规模疾病筛查。附图说明图1是理想状态下PCR产物片段设计图；图2是全血DNA模板的PCR扩增产物毛细管电泳分析图-无突变产物；图3是全血DNA模板的PCR扩增产物毛细管电泳分析图-JAK2V617F突变；图4是全血DNA模板的PCR扩增产物毛细管电泳分析图-CALR基因第九外显子52bp缺失突变；图5是全血DNA模板的PCR扩增产物毛细管电泳分析图-CLAR第九外显子5bp插入突变；图6是1ng/μL浓度的JAK2V617F阳性突变DNA模板PCR扩增产物毛细管电泳分析图；图7是0.1ng/μL浓度的JAK2V617F阳性突变DNA模板PCR扩增产物毛细管电泳分析图；图8是0.01ng/μL浓度的J本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测JAK2 V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组，其特征在于：包括用于JAK2 V617F基因突变的ARMS引物和用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物；其中，所述用于JAK2 V617F基因突变的ARMS引物包括SEQ ID NO：1所示的JAK2野生型正向引物、SEQID NO：2所示的JAK2突变型反向引物、SEQ ID NO：3所示的JAK2内参正向引物和SEQ ID NO：4所示的JAK2内参反向引物，所述用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物包括SEQ ID NO：5所示的CALR正向引物和SEQ ID NO：6所示的CALR反向引物。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR引物组，其特征在于：包括用于JAK2V617F基因突变的ARMS引物和用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物；其中，所述用于JAK2V617F基因突变的ARMS引物包括SEQIDNO：1所示的JAK2野生型正向引物、SEQIDNO：2所示的JAK2突变型反向引物、SEQIDNO：3所示的JAK2内参正向引物和SEQIDNO：4所示的JAK2内参反向引物，所述用于CALR第九外显子基因突变的PCR引物包括SEQIDNO：5所示的CALR正向引物和SEQIDNO：6所示的CALR反向引物。


2.根据权利要求1所述的用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的引物组，其特征在于：所述JAK2野生型正向引物、JAK2内参正向引物和CALR正向引物的5'标记的荧光基团为CY5。


3.用于检测JAK2V617F及CALR第九外显子基因突变的PCR试剂盒，其特征在于：含有2×rTaq的PCR反应液10uL、权利要求1所述的JAK2野生型正向引物、JAK2突变型反向引物、JAK2内参正向引物、JAK2内参反向引物、CALR正向引物和...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁建龙，韩艳秋，师迎旭，
申请(专利权)人：内蒙古医科大学附属医院内蒙古自治区心血管研究所，
类型：发明
国别省市：内蒙;15