斑马鱼模型的重构卵及其构建方法和应用、斑马鱼模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种斑马鱼模型的重构卵及其构建方法和应用、斑马鱼模型的构建方法。该斑马鱼模型的重构卵的构建方法包括如下步骤：合成向导RNA，向导RNA含有能够与靶标片段互补结合的RNA片段，靶标片段针对atp6v1h基因设计；将向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵中，形成重构卵。上述方法构建的重构卵能够用于构建筛选骨质疏松药物的斑马鱼模型。

【技术实现步骤摘要】
斑马鱼模型的重构卵及其构建方法和应用、斑马鱼模型的构建方法
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种斑马鱼模型的重构卵及其构建方法和应用、斑马鱼模型的构建方法。
技术介绍
骨是人体内最坚硬的组织，它具有运动、支持、保护身体内部器官的功能。骨的力学性质为运动提供支持，也为体内脆弱的内脏器官提供保护。同时，骨也是体内钙和磷酸盐的储藏地，人体内99％的钙都集中在骨头中，因此骨是维持人体血钙平衡的重要器官。另外，骨还给骨髓的产生提供了环境，骨髓具有造血和免疫功能，骨髓中的造血干细胞可以被诱导分化成为血细胞进入血液中，所以造血细胞的发育也离不开骨。传统的将骨作为响应激素和饮食影响的被动组织的观念在过去半个世纪受到了颠覆，人们重新认识到骨是一个能对力学需求做出响应的动态适应性组织。因此，骨的健康对于维持人正常生理活动是非常重要的。骨由骨组织、骨髓、骨膜构成。从组织成分上来讲，骨组织是一种结缔组织，其主要组成成分为细胞、纤维和基质。骨组织内的细胞主要有四种：骨原细胞、成骨细胞、骨细胞和破骨细胞。骨原细胞是干细胞，可增殖分化成成骨细胞。成骨细胞是骨组织形成的重要细胞，负责向周围分泌纤维和胞外基质(extracellular，ECM)把自己包裹起来，形成类骨质。而后矿物质沉积到类骨质，形成坚硬的骨组织，而其中的成骨细胞则成熟成为骨细胞。骨细胞嵌在骨内部，它们伸出树突到骨基质中，和其他细胞形成微管网络。破骨细胞来源于造血干细胞，多个巨噬细胞分化、融合形成多核的破骨细胞。破骨细胞分泌蛋白酶、碳酸酐酶和酸等，有着溶解骨胞外基质的功能。骨在生命周期中一直进行着重建，从而保持适当的量。重建过程累积形成的骨量，是由骨形成(boneformation)和骨吸收(boneresorption)之间的平衡来决定。在青少年成长阶段，成骨细胞的活动大于破骨细胞，从而使得骨增长；在老年阶段，破骨细胞的活动大于成骨细胞，从而骨质逐渐丢失。在正常情况下，成骨细胞和破骨细胞的平衡决定着骨质的稳定，而一旦这个平衡被打破，则出现骨异常、骨硬化病(osteopetrosis)或骨质疏松(osteoporosis)等。骨质疏松，是由多种原因导致的骨密度和骨量的下降，其主要特征为骨头疼痛、易骨折。骨质疏松分为原发性骨质疏松和继发性骨质疏松。造成骨质疏松的原因有多种多样，如内分泌性疾病、绝经后雌激素缺乏、营养吸收障碍、类风湿性关节炎、肿瘤等。因此，研究能够治疗骨质疏松的药物迫在眉睫。目前，主要通过构建骨质疏松小鼠模型来筛选治疗骨质疏松的药物。然而，骨质疏松小鼠模型的饲养周期长，十分不利于药物的筛选。
技术实现思路
基于此，有必提供一种斑马鱼模型的重构卵的构建方法，该方法构建的重构卵能够用于构建筛选骨质疏松药物的斑马鱼模型。此外，还提供一种斑马鱼模型的重构卵及其应用、斑马鱼模型的构建方法。一种斑马鱼模型的重构卵的构建方法，包括如下步骤：合成向导RNA，所述向导RNA含有能够与靶标片段互补结合的RNA片段，所述靶标片段针对atp6v1h基因设计；及将所述向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵中，形成重构卵。研究发现，atp6v1h基因与骨骼密度减少有一定的关系，是导致出现骨质疏松的相关基因。上述斑马鱼模型的重构卵的构建方法中，设计针对atp6v1h基因设计的靶向片段，以合成向导RNA，并采用CRISPR/Cas9基因编辑系统对野生型斑马鱼基因组进行修复以敲除野生型斑马鱼的atp6v1h基因，得到的重构卵能够用于构建骨质疏松的斑马鱼模型，同时，斑马鱼的生长周期短，有利于骨质疏松药物的筛选。经试验证明，采用上述构建方法得到的重构卵构建的斑马鱼模型具有脊柱弯曲、椎体钙化结构缺失以及骨量、骨密度降低的表型。其中一个实施例中，所述靶标片段针对所述atp6v1h基因的第四个外显子设计。其中一个实施例中，所述靶标片段的序列如SEQIDNo.1所示。其中一个实施例中，所述合成向导RNA的步骤包括：以骨架质粒为模板，采用正向引物和反向引物进行PCR反应，得到PCR产物，所述正向引物含有所述靶标序列；及将所述PCR产物进行体外转录，得到所述向导RNA。其中一个实施例中，所述骨架质粒为pT7-gRNA质粒；及/或，所述正向引物的序列如SEQIDNo.2所示，所述反向引物的序列如SEQIDNo.3所示。其中一个实施例中，所述将所述向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵中的步骤之前，还包括合成所述Cas9mRNA的步骤：将pT3TS-nCas9n质粒线性化后进行体外转录，得到所述Cas9mRNA。一种由上述斑马鱼模型的重构卵的构建方法构建得到的重构卵。一种斑马鱼模型的构建方法，包括如下步骤：将所述重构卵培养，得到初代斑马鱼突变体；将所述初代斑马鱼突变体内交，得到第二代斑马鱼突变体；及将所述第二代斑马鱼突变体内交，得到所述斑马鱼模型。其中一个实施例中，所述将所述重构卵培养，得到初代斑马鱼突变体的步骤之后，还包括验证所述初代斑马鱼突变体的步骤：将所述初代斑马鱼突变体与所述野生型斑马鱼外交，得到待验证斑马鱼；采用序列如SEQIDNo.4和SEQIDNo.5所示的扩增引物对对所述待验证斑马鱼的基因组进行PCR反应，得到PCR产物；及采用T7核酸内切酶法对所述PCR产物进行鉴定。上述重构卵或上述斑马鱼模型构建方法构建得到的斑马鱼模型在制备治疗骨质疏松的药物中的应用。附图说明图1为atp6v1h基因的结构示意图；图2为野生型斑马鱼与斑马鱼模型中基因组DNA的T7核酸内切酶法鉴定对比图；图3为实施例3中初代斑马鱼突变体与野生型斑马鱼的测序比对图；图4为斑马鱼模型与野生型斑马鱼的身体弯曲对比图；图5为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的脊柱弯曲对比图；图6为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的椎骨对比图；图7为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的椎骨的椎体腔对比图；图8为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼中单个椎骨对比图；图9为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的骨密度的对比图；图10为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的骨量的对比图；图11为X-RAY方式检测的斑马鱼模型与野生型斑马鱼的骨面积的对比图；图12为斑马鱼模型与野生型斑马鱼的染色对比图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。本专利技术提供了一种斑马鱼模型的重构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n合成向导RNA，所述向导RNA含有能够与靶标片段互补结合的RNA片段，所述靶标片段针对atp6v1h基因设计；/n将所述向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵中，形成重构卵。/n

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
合成向导RNA，所述向导RNA含有能够与靶标片段互补结合的RNA片段，所述靶标片段针对atp6v1h基因设计；
将所述向导RNA和Cas9mRNA导入野生型斑马鱼受精卵中，形成重构卵。


2.根据权利要求1所述的斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，所述靶标片段针对所述atp6v1h基因的第四个外显子设计。


3.根据权利要求1所述的斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，所述靶标片段的序列如SEQIDNo.1所示。


4.根据权利要求1～3任一项所述的斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，所述合成向导RNA的步骤包括：
以骨架质粒为模板，采用正向引物和反向引物进行PCR反应，得到PCR产物，所述正向引物含有所述靶标序列；及
将所述PCR产物进行体外转录，得到所述向导RNA。


5.根据权利要求4所述的斑马鱼模型的重构卵的构建方法，其特征在于，所述骨架质粒为pT7-gRNA质粒；
及/或，所述正向引物的序列如SEQIDNo.2所示，所述反向引物的序列如SEQIDNo.3所示。


6.根据权利要求1所述的斑马鱼模型的重构卵的构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：林硕，秦伟，
申请(专利权)人：北京大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44