源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段及其应用，属于植物基因工程技术领域，将如SEQ ID NO.1所示的改良DNA序列，以“尾尾相连”的方式组成RNAi片段，其序列如SEQ ID NO.2所示。将该RNAi片段应用于转基因植株中，证明了该RNAi片段具有调控木质素合成的作用。本发明专利技术通过对尾叶桉CAD基因序列的研究，有助于推动尾叶桉转基因定向调控木质素合成的基因工程育种。

【技术实现步骤摘要】
源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一段源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段的应用。
技术介绍
桉树是桃金娘科桉属植物的总称，原产地为澳大利亚。广西的桉树研究在我国处于领先地位，20世纪70年代初期就开始引种，经过多年的引种试验及杂交选育，得到了多个优良树种、优良种源及优良家系。桉树生长快、材质好，广西全区桉树面积居全国首位，已经成为短周期原料林的主要造林树种。尾叶桉GLU4无性系(EucalyptusurophyllacloneGLU4)是广西广泛种植的桉树良种，因其纤维素含量、纤维素长度等制浆指标显著优于其他桉树品种，成为纸浆材造林首选树种。从纸浆材生产需求出发，希望木材中的木质素含量更低所以定向调控木质素合成，成为纸浆材品质提升的主要研究策略。CAD催化肉桂醇等几种木质素单体的直接前体合成，被认为是细胞木质化的标志。目前，已从多种植物中克隆了CAD基因，并利用一系列转基因方法(正义、反义等)对其功能进行了研究。在反义抑制CAD的杨树中，低水平CAD活性的植株木质部呈现红褐色，并且木质素更容易被分离，制浆效率提高。在抑制CAD活性的转基因苜宿中，木质素含量不受影响，但改变了S/G比值，表明CAD也参与了木质素单体的特异性合成。在玉米bml突变株中，CAD酶活性下降60％，木质素含量降低近80％。但至目前为止，在尾叶桉中尚未有CAD基因序列的报道，利用其中的基因序列进行基因工程调控尚未开展。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了源于尾叶桉CAD基因的RNAi片段，以及利用此RNAi片段构建得到的植物表达载体、宿主细胞等在植物木质素单体合成调控中的应用，有助于深入尾叶桉CAD基因功能的研究，以有效地定向调控木质素合成，在木质素合成调控的基因工程研究中的发挥重要作用。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段，是由一段源于尾叶桉CAD基因的改良的DNA序列以“尾尾相连”的方式组成；所述改良的DNA序列具有如SEQIDNO.1所示DNA序列。SEQIDNO.1gaatttgccacagttacattcaccaggtcaagaattatcttggc进一步地，所述RNAi片段的DNA序列如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2gaatttgccacagttacattcaccaggtcaagaattatcttggcgccaagataattcttgacctggtgaatgtaactgtggcaaattc本专利技术提供一种重组植物表达载体，包含所述的RNAi片段。进一步地，所述重组植物表达载体是以pCAMBIA3301为基础，构建得到的重组载体pCAMBIA3301-S1。本专利技术提供一种宿主细胞，包含所述的RNAi片段或所述的重组植物表达载体。进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌、农杆菌或植物细胞。如大肠杆菌JM109菌株、农杆菌LBA4404菌株。本专利技术提供一种源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段的应用，是将所述的RNAi片段、所述的重组植物表达载体、或所述的宿主细胞应用于降低植物木质素合成中。进一步地，是将所述的RNAi片段或重组植物表达载体转化入植物，定向降低植物木质素合成。进一步地，是将所述宿主细胞侵染植物。具有降低植株木质素含量的效果。本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术摒弃了传统研究策略中使用全长基因的思路，通过对尾叶桉CAD基因序列进行生物信息学分析，根据序列编码蛋白的结构域预测，选取了其中一段较短的DNA序列，该段序列编码蛋白包含了与酶活性重要相关的NAD(P)结合位点、底物结合位点和Zn结合催化位点。在此基础上，根据陆生植物CAD序列同源比对分析结果，对序列中的部分碱基进行了改良，得到了改良后的DNA序列：S(SEQIDNO.1：gaatttgccacagttacattcaccaggtcaagaattatcttggc)。2.利用本专利技术获得的改良后的DNA序列构建成RNAi片段，可以高效识别CAD基因中的NAD(P)结合位点、底物结合位点和Zn结合催化位点目标片段，并引发RNA干扰，抑制CAD基因表达，从而降低植物中CAD酶活性。3.本专利技术在应用中仅使用较短的DNA序列“尾尾相连”组成RNAi片段，通过序列合成的方式商业化的获得目标RNAi片段，避免了传统研究策略中利用限制性内切酶的构建过程，大大简化了实验步骤，缩短实验周期。4.本专利技术对RNAi片段转化烟草植株的木质素含量进行检测，结果显示转基因烟草植株中木质素含量比野生型烟草降低15.26％，验证了RNAi片段对木质素合成的调控作用。5.本专利技术在烟草中转化该RNAi片段得到的转基因烟草植株，证明了这段RNAi片段具有抑制木质素合成的作用，可达到降低植株木质素含量的效果，有助于深入尾叶桉CAD基因功能的研究，并推动尾叶桉转基因定向调控木质素合成的基因工程育种。附图说明图1是本专利技术实施例中野生型植株茎部切片的照片。图2是本专利技术实施例中转基因型植株茎部切片的照片。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、改良的DNA序列利用Blastp、ProtParam、psipred、SWISS-MODEL生物信息学软件对尾叶桉CAD基因序列进行序列分析，筛选得到一段编码蛋白序列富含NAD(P)结合位点、底物结合位点和Zn结合催化位点的候选DNA序列(SEQIDNO.3：gaatttgccacagtgacattcaccagatcaagaatgatcttggc)，以此候选序列为基础，利用Blastn等在线工具将候选序列与陆生植物CAD基因序列别对，根据序列同源性、一致性分析结果，对候选序列进行改良，得到一段44bp序列S(SEQIDNO.1)，序列信息为：5'–gaatttgccacagttacattcaccaggtcaagaattatcttggc-3'。实施例2、构建RNAi片段根据实施例1的序列S，以“尾尾相连”的方式设计成反向重复序列S1(SEQIDNO.2)，序列信息为：5'–gaatttgccacagttacattcaccaggtcaagaattatcttggcgccaagataattcttgacctggtgaatgtaactgtggcaaattc-3'。实施例3、构建RNAi表达载体在实施例2所述序列S1两端附加XhoI酶切位点后，交由生物公司合成序列，得到携带目标片段的克隆载体pUC57-S1。取携带pUC57-S1质粒的大肠杆菌过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段，其特征在于，是由一段源于尾叶桉CAD基因的改良的DNA序列以“尾尾相连”的方式组成；所述改良的DNA序列具有如SEQ ID NO.1所示DNA序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段，其特征在于，是由一段源于尾叶桉CAD基因的改良的DNA序列以“尾尾相连”的方式组成；所述改良的DNA序列具有如SEQIDNO.1所示DNA序列。


2.根据权利要求1所述的源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段，其特征在于，所述RNAi片段的DNA序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种重组植物表达载体，其特征在于：包含权利要求1或2所述的RNAi片段。


4.根据权利要求3所述的重组植物表达载体，其特征在于，所述重组植物表达载体是以pCAMBIA3301为基础，构建得到的重组载体pCAMBIA3301-S1。


5.一种宿主细胞，其特征在于：包含如权利要求1或2所述的R...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈博雯，李军集，肖玉菲，张烨，张晓宁，刘海龙，覃子海，
申请(专利权)人：广西壮族自治区林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：广西;45