联合检测待测样品中多种抗生素的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提出了一种联合检测待测样品中多种抗生素的方法。根据本发明专利技术的实施例，所述方法包括：1)将所述待测样品进行提取处理；2)将所述提取液进行液相色谱分离‑质谱检测；3)基于液相色谱分离‑质谱检测结果，确定所述待测样品中多种抗生素的含量。根据本发明专利技术实施例的检测方法能够同时检测出待测样品中多种抗生素的含量，用于科学研究或用于监测人体内各种抗生素水平，合理规避抗生素的使用，使得检测成本降低，效率提高。该方法灵敏度高、特异性强和准确性高。

【技术实现步骤摘要】
联合检测待测样品中多种抗生素的方法及试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域，具体地，本专利技术涉及联合检测待测样品中多种抗生素的方法及试剂盒。
技术介绍
抗生素是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)产生、能抑制或杀灭其他微生物的物质。抗生素的使用对医学产生了巨大的跨时代的意义，是医院中日常应用量最大的抗感染药物。但是现在抗生素的滥用现象在我国相当普遍。我国住院患者抗生素药物使用率高达80％，其中联合使用两种以上抗生素的占58％，远高30％的国际水平。另有外部环境(食品、水体环境等)中的抗生素向人体内传递，使人体内会积累部分抗生素，影响正常生理机能(如表2)。甚至导致耐药菌的产生和变异，从而使一些常用抗生素失去功效，催生了抗生素治不死的超级细菌。鉴于此，各个国家都越来越重视抗生素的监测，因此，监测人体内抗生素水平，合理规避抗生素的使用，对感染性疾病诊断有着十分重要的意义。目前对抗生素的监测主要是针对体外环境(食品、水体环境等)抗生素残留的监测，检测技术包括酶联免疫分析法、薄层色谱法、放射免疫法、高效液相色谱法等。而针对人体内抗生素水平检测鲜有报道，且现有检测抗生素种类较少，检测限偏高。因此，快速监测人体内各种抗生素水平的技术尤为重要。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本申请提出采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，同时精准定量测定尿中各种抗生素的浓度，具有高通量、快速的优点，在临床实践和科研实践中具有较高应用价值。同时本申请也提出了利用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测尿中抗生素含量的试剂盒，该试剂盒实现了快速精准地检测人尿中40种抗生素含量。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种联合检测待测样品中多种抗生素的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：1)将所述待测样品进行提取处理；2)将所述提取液进行液相色谱分离-质谱检测；3)基于液相色谱分离-质谱检测结果，确定所述待测样品中多种抗生素的含量。根据本专利技术实施例的检测方法能够同时检测待测样品中多种抗生素的含量，基于待测样品中多种抗生素的含量的检测结果，可进一步用于科学研究，如若抗生素来源于被给药动物，则可根据检测结果判定，动物在给药前后，体内抗生素的含量变化，从而筛选出具有调节体内抗生素含量功能的药物；也可进一步用于监测人体内各种抗生素水平，检测效率高，合理规避抗生素的使用。根据本专利技术实施例的检测方法采用液相色谱分离，可有效减少同分异构体的干扰，同时利用质谱检测本身的分辨率，可有效消除交叉反应，进而能快速定量对多种抗生素进行特异性检出，具有通量高、成本低的优势。根据本专利技术实施例的检测方法灵敏度高、特异性强、稳定性和准确性高。根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步具有如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，所述待测样本为尿液样本。一般情况下抗生素会在体内逐渐随代谢排除，但随着抗生素的滥用等情况的出现，会出现体内抗生素长期残留的情况，从而耐药性增强；而尿液是由人体代谢产生，结合受检者给药情况等因素，在一定程度上可以反应人体内近期抗生素的残留水平。根据本专利技术实施例的检测方法，可实现尿液样本中抗生素含量的检测，进而可实现对人体中抗生素含量的无创监测。根据本专利技术的实施例，所述提取处理是在提取工作液中进行的，所述提取工作液包括抗生素同位素内标品以及有机溶剂或酸试剂；优选地，所述有机溶剂为甲醇；优选地，所述酸试剂为磺基水杨酸；优选地，所述提取处理是通过SPE柱提取进行的，所述SPE柱为Cleanert-PEP-2SPE60mg/3mL。在本申请中，提取工作液中的有机溶剂或酸试剂统称为沉淀剂。专利技术人发现，提取工作液的成分对于同位素内标的稳定性具有显著影响，采用SPE柱提取，可提高对目标分析物检测的稳定性和准确度。根据本专利技术的实施例，所述提取处理是在如下条件下进行的：将所述待测样品置于所述提取工作液中，并在4℃、4000rpm、避光的条件下进行离心20min，所述待测样品与所述提取工作液的体积比为1:3。专利技术人发现，所述提取处理在上述条件下进行，可保证尿液中的抗生素充分进入提取液中，而抗生素不会发生降解，为后续提取液的液相色谱分离-质谱检测奠定了基础。根据本专利技术的实施例，提取处理后、液相色谱分离-质谱检测前，进一步将所述提取液进行氮吹干和复溶处理，以便获得待上样液。进而可进一步将提取液中的干扰物去除，提高液相色谱分离-质谱检测的准确性。根据本专利技术的实施例，所述复溶处理是在复溶剂中进行的，所述复溶剂包括水和甲醇，所述水和甲醇的体积比为7:3。采用包括水和甲醇的复溶剂对氮吹干后产物进行复溶，可最大限度的避免干扰离子的引入，同时30％甲醇溶液中溶解度高，进而可进一步提高液相色谱分离-质谱检测的准确性和稳定性。根据本专利技术的实施例，所述液相色谱分离是在如下条件下进行的：进样体积为5uL，色谱柱为ACE-Excel-1.7-C18-PFP100*2.1mm(1.7μm)或Waters-ACQ-UPLC-C18-PFP100*2.1mm(1.7μm)或Waters-ACQ-UPLC-C18-BEH100*2.1mm(1.7μm)，柱温为40℃，流动相A为含有0.1％甲醇的水溶液，流动相B为含有0.1％甲酸的甲醇溶液，每个样品检测时间为6.5min，洗脱梯度如表1所示。表1：时间点min流速mL/min％B流速曲线00.415-0.500.41560.550.425102.000.430102.050.44563.050.44583.750.46563.800.410065.000.410065.050.41566.500.415专利技术人发现，将待上样液在上述液相色谱检测条件下进行分离和检测，对抗生素的特异性分离和检测效果佳，各目标分析抗生素的检测信号强(峰高)，与其他非目标分析抗生素的检测信号的分离度高、差别大。根据本专利技术的实施例，所述质谱检测是在如下条件下进行的：所述质谱检测是在如下条件下进行的：串联质谱仪电喷雾阳离子方式(ESI+)，多反应监测模式(MRM)，离子源温度600℃，毛细管电压为5500kV，源气参数如表2所示，离子对信息如表3所示。表2：源气参数(Sourcegasparameters)CurtainGas(CUR)气帘气35.0Collis本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测样品中多种抗生素的方法，其特征在于，包括：/n1)将待测样品进行提取处理；/n2)将所述提取液进行液相色谱分离-质谱检测；/n3)基于液相色谱分离-质谱检测结果，确定所述待测样品中多种抗生素的含量。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测样品中多种抗生素的方法，其特征在于，包括：
1)将待测样品进行提取处理；
2)将所述提取液进行液相色谱分离-质谱检测；
3)基于液相色谱分离-质谱检测结果，确定所述待测样品中多种抗生素的含量。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本为尿液样本。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取处理是在提取工作液中进行的，所述提取工作液包括抗生素同位素内标品以及有机溶剂或酸试剂；
优选地，所述有机溶剂为甲醇；
优选地，所述酸试剂为磺基水杨酸；
优选地，所述提取处理是通过SPE柱提取进行的，所述SPE柱为Cleanert-PEP-2SPE60mg/3mL。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述提取处理是在如下条件下进行的：
将所述待测样品置于所述提取工作液中，并在4℃、4000rpm、避光的条件下进行离心20min，所述待测样品与所述提取工作液的体积比为1:3。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取处理后、液相色谱分离-质谱检测前，进一步将所述提取液进行氮吹干和复溶处理，以便获得待上样液；
任选地，所述复溶处理是在复溶剂中进行的，所述复溶剂包括水和甲醇，所述水和甲醇的体积比为7:3。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱分离是在如下条件下进行的：
进样体积为5uL，色谱柱为ACE-Excel-1.7-C18-PFP100*2.1mm(1.7μm)或Waters-ACQ-UPLC-C18-PFP100*2.1mm(1.7μm)或Waters-ACQ-UPLC-C18-BEH100*2.1mm(1.7μm)，柱温为40℃，流动相A为含有0.1％甲醇的水溶液，流动相B为含有0.1％甲酸的甲醇溶液，每个样品检测时间为6.5min，洗脱梯度如表1所示。


7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱检测是在如下条件下进行的：串联质谱仪电喷雾阳离子方式(ESI+)，多反应监测模式(MRM)，离子源温度600℃，毛细管电压为5500kV，源气参数如表2所示，离子对信息如表3所示；
任选地，所述多种抗生素包括表4所示抗生素；
任选地，基于液相色谱分离-质谱检测出的抗生素的色谱峰面积，确定所述抗生素的含量；
任选地，进一步包括同时将质控品进行抗生素含量检测，所述质控品为含有已知浓度的抗生素的样品。


8.一种检测样品中多种抗生素的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡云枫，饶维桥，廖云莉，陈晓敏，郭春静，林梁，訾金，刘斯奇，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44