一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组和试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种RT‑LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组和试剂盒及其应用。所述引物组的6条引物位于口蹄疫病毒高度保守的3D蛋白基因内，全基因组的7776‑8050 bp处，本发明专利技术同时提供一种RT‑LAMP法检测口蹄疫病毒的试剂盒，检测应用时可根据颜色反应读取结果，绿色或黄绿色为口蹄疫病毒核酸阳性，橙黄色或棕红色为阴性；或者通过核酸电泳分析是否出现梯形条带，如果出现梯状条带，说明样品为阳性，否则为阴性。本发明专利技术具有高特异性、高敏感性、操作简便、对仪器设备要求低的特点，能够较好满足目前对口蹄疫病毒现场检测的迫切需要，适合基层兽医、进出口检疫部门、养殖场、屠宰场等现场快速可视化检出口蹄疫病毒。

【技术实现步骤摘要】
一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组和试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物诊断检测
，具体涉及一种检测口蹄疫病毒的群特异性RT-LAMP检测引物组、试剂盒和方法。技术背景口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的重大动物疫病之一，主要感染猪、牛、羊等偶蹄类动物，感染动物发病率和死亡率均较高，世界动物卫生组织(OIE)将其归为A类动物疫病之首，我国也将其列为一类动物疫病。口蹄疫病毒属小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，共7个血清型(O、A、Asia-1、C、SAT1、SAT2、SAT3型)，70多个亚型，血清型间无交叉保护作用。口蹄疫的预防和控制是世界性难题，全球每年因该病造成的直接经济损失到数百亿美元。近年来，我国存在的口蹄疫病毒主要为口蹄疫O型、A型、Asia-1型。目前口蹄疫病毒诊断技术方面存在的问题主要包括：风险监视手段单一，综合感知能力不足；一线检测试剂匮乏，早期发现能力不足。导致口蹄疫疫情往往是大范围流行时才被发现，防控措施的实施严重滞后，与我国畜牧业大国地位极不相符。早期及时发现动物疫情是动物疫病防控的关键，目前常用的口蹄疫病毒检测方法为PCR检测法，这需要一定的技术水平和硬件条件，然而与动物疫病早期接触的往往是基层兽医和养殖场技术员，他们对动物疫病的确诊技术水平相对较低，且受到基层地区简陋条件的制约，会造成一些隐性带毒或早期处于潜伏期的感染动物无法及时甄别、漏检。2000年日本学者Notomi等专利技术了一种基因恒温扩增方法，命名为环介导等温扩增技术(LAMP)。它针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物(FIP、F3、BIP、B3)，在具有链置换活性的BstDNA聚合酶作用下，60～65℃等温高效特异性的扩增目的基因。2002年，Nagae等在此基础上添加了2条环状引物：上游环状引物(LF)和下游环状引物(LB)，提高了反应速度，进一步缩短了反应时间。LAMP技术具有操作简便、可视化、高敏感性、高特异性、仪器设备要求低等诸多优点，该技术自产生之后已经在转基因食品检测、动物疫病诊断及动物胚胎的性别鉴定等领域得到广泛的推广及应用，因此建立口蹄疫病毒群特异性RT-LAMP检测方法，实现对口蹄疫病毒的早期现场快速检出，对于口蹄疫疫情防控和畜牧业健康发展具有重要意义。目前实践中关于口蹄疫RT-LAMP检测主要是M.Madhanmohan等2013年建立的，是分别针对O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒、Asia-1型口蹄疫病毒设计了3套引物进行检测，并且O型口蹄疫毒株仅针对中东南亚毒株，还没有实现用一套引物检出3个血清型，而且对于中国和东南亚国家流行的毒株未报到检出情况，由于口蹄疫病毒变异性较强，不同毒株间存在较大差异，现在这种口蹄疫RT-LAMP检测不一定适用于中国和东南亚国家毒株。Da-RaeLim等2018年针对O型口蹄疫病毒VP3基因序列建立的改良的RT-LAMP，敏感性为104半数细胞感染量(TCID50/mL)或者105拷贝数/μL。近年来在国内也有关于口蹄疫病毒RT-LAMP方法的研究，但也普遍存在着对不同血清型的敏感性不同、检测敏感性不够、覆盖面不全，不能实现现场可视化检出等问题。特别是，目前口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法存在的问题是：1、口蹄疫病毒群特异性片段高度保守片段未找到，多数研究成果仅针对口蹄疫病毒1个血清型(主要为O型)，少数已建立的通用型检测方法不能实现主要流行毒株的全覆盖，或者敏感性较低；2、已有的实现可视化的研究成果，在反应完成后均需要打开反应管盖子添加荧光染料，易造成反应产物污染环境，再次检测时出现假阳性检测结果。
技术实现思路
为了实现口蹄疫病毒快速简便、可视化的检出，本专利技术提供了一组口蹄疫病毒群特异性的RT-LAMP引物组及一种口蹄疫病毒群特异性的RT-LAMP检测试剂盒和应用方法，可以特异性检出口蹄疫病毒，通过观察颜色反应确定样品中口蹄疫病毒的阴性或阳性。本专利技术提供一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组，所述引物组包括6条引物，分别为：两条外引物：正向外引物F3、反向外引物B3；两条内引物：正向内引物FIP、反向内引物BIP；两条环引物：上游环引物LF、下游环引物LB，所述6条引物具体序列如下：正向外引物F3：5'-GACAAAAGYGACAAAGGTT-3'；反向外引物B3：5'-TAAAGTGATCTGTAGCTTGG-3'；正向内引物FIP：5'-CGTGCAAAGGAGAGGATAGCCTC-CYGATGTCACTTTCCTCAAAAG-3'；反向内引物BIP：5'-GACCATACAGGAGAAGTTGA-AAGAGRCCCTGGAAGGGCTCRAA-3'；上游环引物LF：5'-TAAAACCCAGTTCCATA-3'；下游环引物LB：5'-CTCGCCGTCCACTCTGG-3'；所述6条引物位于口蹄疫病毒高度保守的3D蛋白基因内，全基因组的7776-8050bp处，所述序列如SEQIDNO:1所示，其中所述反向外引物B3、反向内引物BIP和下游环引物LB为该基因片段的互补基因序列。进一步，所述6条引物在所述全基因组的7776-8050bp处的具体位置为：正向外引物F3：7776bp～7794bp；反向外引物B3：8031bp～8050bp；正向内引物FIP：7899bp～7921bp、7816bp～7837bp；反向内引物BIP：7928bp～7947bp、8001bp～8023bp；上游环引物LF：7854bp～7870bp；下游环引物LB：7962bp～7978bp。本专利技术同时提供一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的试剂盒，该试剂盒内包含RT-LAMP反应管、阳性对照样品、阴性对照样品、比色卡，所述RT-LAMP反应管内包括扩增反应体系和显色体系，扩增反应体系位于RT-LAMP反应管底部，显色体系位于RT-LAMP反应管管盖处；所述扩增反应体系中引物组为权利要求1所述的引物组。进一步，该试剂盒中引物组的正向外引物F3和反向外引物B3为外引物、正向内引物FIP和反向内引物BIP为内引物、上游环引物LF和下游环引物LB为环引物，所述外引物：内引物：环引物的摩尔含量比为1:8:2。进一步，所述扩增反应体系共23μL，具体包括：进一步，所述显色体系是用石蜡油封闭的荧光染料，所述荧光染料为PicoGreen；密封荧光染料的方式为：制备成品试剂盒时在RT-LAMP反应管管盖中滴加4μLPicoGreen，随后滴加15μL石蜡油，把PicoGreen封闭于反应管管盖处。进一步，所述阳性对照样品为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照样品为DEPC水。进一步，所述的试剂盒的检测应用包括如下步骤：步骤(1)提取组织样品中的病毒RNA；步骤(2)取2μL病毒RNA加入到RT-LAMP反应管的扩增反应体系中，同时另取2个RT-LAMP反应管分别加入2μL试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组，所述引物组包括6条引物，分别为：两条外引物：正向外引物F3、反向外引物B3；两条内引物：正向内引物FIP、反向内引物BIP；两条环引物：上游环引物LF、下游环引物LB，其特征在于，所述6条引物具体序列如下：/n正向外引物F3：5'-GACAAAAGYGACAAAGGTT-3'；/n反向外引物B3：5'-TAAAGTGATCTGTAGCTTGG-3'；/n正向内引物FIP：/n5'-CGTGCAAAGGAGAGGATAGCCTC-CYGATGTCACTTTCCTCAAAAG-3'；/n反向内引物BIP：/n5'-GACCATACAGGAGAAGTTGA-AAGAGRCCCTGGAAGGGCTCRAA-3'；/n上游环引物LF：5'-TAAAACCCAGTTCCATA-3'；/n下游环引物LB：5'-CTCGCCGTCCACTCTGG-3'；/n所述6条引物位于口蹄疫病毒高度保守的3D蛋白基因内，全基因组的7776-8050bp处，所述序列如SEQ ID NO:1所示，其中所述反向外引物B3、反向内引物BIP和下游环引物LB为该基因片段的互补基因序列。/n...

【技术特征摘要】
1.一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组，所述引物组包括6条引物，分别为：两条外引物：正向外引物F3、反向外引物B3；两条内引物：正向内引物FIP、反向内引物BIP；两条环引物：上游环引物LF、下游环引物LB，其特征在于，所述6条引物具体序列如下：
正向外引物F3：5'-GACAAAAGYGACAAAGGTT-3'；
反向外引物B3：5'-TAAAGTGATCTGTAGCTTGG-3'；
正向内引物FIP：
5'-CGTGCAAAGGAGAGGATAGCCTC-CYGATGTCACTTTCCTCAAAAG-3'；
反向内引物BIP：
5'-GACCATACAGGAGAAGTTGA-AAGAGRCCCTGGAAGGGCTCRAA-3'；
上游环引物LF：5'-TAAAACCCAGTTCCATA-3'；
下游环引物LB：5'-CTCGCCGTCCACTCTGG-3'；
所述6条引物位于口蹄疫病毒高度保守的3D蛋白基因内，全基因组的7776-8050bp处，所述序列如SEQIDNO:1所示，其中所述反向外引物B3、反向内引物BIP和下游环引物LB为该基因片段的互补基因序列。


2.根据权利要求1所述RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组，其特征在于：所述6条引物在所述全基因组的7776-8050bp处的具体位置为：
正向外引物F3：7776bp～7794bp；
反向外引物B3：8031bp～8050bp；
正向内引物FIP：7899bp～7921bp、7816bp～7837bp；
反向内引物BIP：7928bp～7947bp、8001bp～8023bp；
上游环引物LF：7854bp～7870bp；
下游环引物LB：7962bp～7978bp。


3.一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的试剂盒，该试剂盒内包含RT-LAMP反应管、阳性对照样品、阴性对照样品、比色卡，其特征在于：所述RT-LAMP反应管内包括扩增反应体系和显色体系，扩增反应体系位于RT-LAMP反应管底部，显色体系位于RT-LAMP反应管管盖处；所述扩增反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗海生，谢佳芮，寇美玲，李乐，廖德芳，李华春，
申请(专利权)人：云南省畜牧兽医科学院，
类型：发明
国别省市：云南;53