一种产碱假单胞菌Pseudomonas sp.H3，筛选方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种产碱假单胞菌Pseudomonas sp.H3，筛选方法及用途。产碱假单胞菌Pseudomonas sp.H3于2020年04月23日保藏，其保藏编号为CGMCC No.19713。该菌可以利用餐厨废油脂为底物高效合成PHA。批次实验PHA合成效率可达65％，PHA产量为2.6g/L。发酵培养，补料实验PHA的合成效率可达53％，产量可达8.6g/L。

【技术实现步骤摘要】
一种产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3，筛选方法及用途
本专利技术涉及微生物菌株领域，尤其涉及一种产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3，筛选方法及用途。
技术介绍
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是微生物细胞内的碳源在氮、磷或硫被限制的条件下的代谢转化而产生的，是一种可完全生物降解的高分子生物聚酯，其在降解过程中不产生任何有毒化合物。PHA与传统的化工合成的塑料具有相似的材料学性质，更具有材料多变性、非线性光学性能、压电性能、气体阻隔性能、热塑性、生物可降解性、良好的生物相容性等优点，被视为石油工业塑料的理想替代品。然而较高的生产成本，限制了PHA的产业化生产和大规模应用。大量研究发现自然界存在丰富的微生物种类，可以通过发酵合成PHA。但是在目微生物发酵过程中，底物消耗占比较大，选择价格低廉的底物可以很大程度上降低PHA的生产成本。餐厨废油脂一般是指地沟油、潲水油、煎炸废油、动物废弃油脂等，其低市场价值，高含碳量等优点，可作为微生物培养的有效碳源。以餐厨废油脂作为PHA的合成底物，可以至少降低50％的生产成本。另一方面，从餐厨废油脂污染介质中筛选具有利用餐厨废油脂合成PHA能力的微生物，可以实现餐厨废油脂的高附加值利用，同时大幅度降解PHA的生产成本。经检索，现有技术已有关于微生物合成PHA的方案公开。中国专利申请CN110438030A公开了一种恶臭假单胞菌PseudomonasputidaWP07、制备方法及用途。该专利技术通过微生物法可以将泔水油转化为具有环境亲和性的可生物降解塑料PHA，可实现泔水油资源化利用与无害化处理，同时降低PHA的制备成本。然而该专利技术的菌株筛选于油污染土壤，虽然可以利用泔水油制备PHA,但是PHA产量太低。中国专利申请CN102206596A公开了一株聚羟基脂肪酸酯合成菌及其发酵培养方法。该菌株能以葡萄糖为单一碳源合成短链与中长链共聚的PHA，该PHA由多种短链单体与中长链单体组成，具有更加优良的机械和加工性能。但是并未提及利用餐厨废油脂作为碳源合成PHA，也未提及PHA的合成效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用餐厨废油脂合成聚羟基脂肪酸酯的产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3。为实现上述目的，本专利技术提供一种产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3，其特征在于，所述产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3的保藏编号为CGMCCNo.19713。本专利技术还提供一种述产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤，富集驯化：将被油污染的样品加入到含有餐厨废油脂的无机盐培养基1中，优选的，餐厨废油脂的含量为50g/L；置于恒温箱中培养，优选的，30℃恒温箱中培养5-10天；取5-20mL的培养液转接入新鲜的含有餐厨废油脂的无机盐培养基1中，置于恒温箱中培养，继续之前的操作，继续转接培养，每次转接使用的新鲜的含有餐厨废油脂的无机盐培养基1中的餐厨油量都高于前一培养基，直到餐厨废油脂含量达到100g/L；分离纯化：利用生理盐水将上述所得的培养液稀释104-6倍后，涂布于含油的筛选培养基上，置于恒温培养箱中培养；优选的，25-30℃，150-200rpm恒温培养箱中培养24-72h；利用365nm紫外灯在黑暗处观察平板，挑选出发荧光的菌株，并将其划线于LB培养基上，长出的菌即为产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3；所述无机盐培养基1的成分为：(NH4)2SO4:1g/L；KH2PO4:1g/L；Na2HPO4·12H2O:11.1g/L；MgSO4:0.2g/L；微量元素液(FeCl3:9.7g/L；CaCl2:7.8g/L；CuSO4·5H2O:0.156g/L；CoCl2：0.119g/L；NiCl2:0.118g/L；CrCl2:0.062g/L溶解于0.1M盐酸中)：1mL/L。所述筛选培养基为无机盐培养基1中加入0.5μg/mL尼罗蓝溶液，10-30g/L餐厨废油脂和2％琼脂粉，高温121℃灭菌21min、冷却凝固后即获得筛选培养基；其中尼罗蓝溶液为1g尼罗蓝溶解于100mL二甲基亚砜中，充分溶解后即为尼罗蓝溶液。进一步，餐厨废油脂为煎炸废油脂，蒸煮废油脂，地沟油，潲水油，餐厨垃圾处理后分离得到的混合废油脂，植物、动物提取的废弃油脂或者上述任意两种或者两种以上的混合。本专利技术还提供一种所述产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3的用途。进一步，所述用途是指用于将餐厨废油脂合成聚羟基脂肪酸酯的用途。进一步，所述餐厨废油脂为煎炸废油脂，蒸煮废油脂，地沟油，潲水油，餐厨垃圾处理后分离得到的混合废油脂，植物、动物提取的废弃油脂或者上述任意两种或者两种以上的混合；任选的，所述聚羟基脂肪酸酯其结构单体包含C8，C10和C12单体的3-羟基脂肪酸酯。本专利技术提供一种利用所述产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，包括如下步骤，种子液和菌悬液的制备：将产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3接种至LB培养基中培养至对数生长期；优选12-16h后获得种子液，种子液通过离心获得的菌体通过添加生理盐水制备成OD600＝1.0-2.0的菌悬液；接种：无机盐培养基2中添加10-50g/L的餐厨废油脂，接种1％-5％的上述所得菌悬液后摇床培养；优选的，30℃，150-200rpm的摇床培养48-96h；菌体分离及净化：将上述所得离心得到菌体，向菌体中加入去离子水或超纯水稀释10-15倍充分混合后，再加入和待稀释菌液等体积的正己烷以去除杂质和油脂，离心、冷冻干燥后得到干菌体；聚羟基脂肪酸酯的提取：往所得干菌体中加入氯仿，优选的，氯仿的加入量为50-100mL/g干菌体；超声处理以破碎细胞，优选的，超声处理10-30min；之后利用水浴磁力搅拌器在80-100℃，优选90℃下充分加热搅拌3-6h，优选4h；离心去除菌渣，初步得到氯仿相的聚羟基脂肪酸酯；聚羟基脂肪酸酯的纯化：向氯仿相的聚羟基脂肪酸酯中加入2％-5％的去离子水或超纯水充分震荡洗涤后离心得到纯净氯仿相的聚羟基脂肪酸酯，最后将纯净氯仿相的聚羟基脂肪酸酯倒入通风橱中的培养皿，氯仿完全挥发后得到纯化的聚羟基脂肪酸酯；所述无机盐培养基2的组成为：KH2PO4:1.5g/L；Na2HPO4·12H2O:8.95g/L；MgSO4:0.098g/L；CaCl2:0.0076g/L；1mL/L微量元素液(H3BO3：0.3g/L；CoCl2·6H2O:0.2g/L；MnCl2·4H2O:0.03g/L；NaMO4·2H2O:0.03g/L；NiCl2·6H2O:0.02g/L；CuSO4·5H2O:0.01g/L；ZnCl2:0.047g/L)，氮源：0.32gN/L。进一步，所述氮源可为尿素，NH4Cl，(NH4)2SO4，NH4NO3。进一步，所述餐厨废油脂为煎炸废油脂，蒸煮废油脂，地沟油，潲水油、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产碱假单胞菌Pseudomonas sp.H3，其特征在于，所述产碱假单胞菌Pseudomonas sp.H3的保藏编号为CGMCC No.19713。/n

【技术特征摘要】
1.一种产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3，其特征在于，所述产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3的保藏编号为CGMCCNo.19713。


2.一种如权利要求1所述产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤，
富集驯化：将被油污染的样品加入到含有餐厨废油脂的无机盐培养基1中，优选的，餐厨废油脂的含量为50g/L；置于恒温箱中培养，优选的，30℃恒温箱中培养5-10天；取5-20mL的培养液转接入新鲜的含有餐厨废油脂的无机盐培养基1中，置于恒温箱中培养，继续之前的操作，继续转接培养，每次转接使用的新鲜的含有餐厨废油脂的无机盐培养基1中的餐厨油量都高于前一培养基，直到餐厨废油脂含量达到100g/L；
分离纯化：利用生理盐水将上述所得的培养液稀释104-6倍后，涂布于含油的筛选培养基上，置于恒温培养箱中培养；优选的，25-30℃，150-200rpm恒温培养箱中培养24-72h；利用365nm紫外灯在黑暗处观察平板，挑选出发荧光的菌株，并将其划线于LB培养基上，长出的菌即为产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3；
所述无机盐培养基1的成分为：(NH4)2SO4:1g/L；KH2PO4:1g/L；Na2HPO4·12H2O:11.1g/L；MgSO4:0.2g/L；微量元素液(FeCl3:9.7g/L；CaCl2:7.8g/L；CuSO4·5H2O:0.156g/L；CoCl2：0.119g/L；NiCl2:0.118g/L；CrCl2:0.062g/L溶解于0.1M盐酸中)：1mL/L；
所述筛选培养基为无机盐培养基1中加入0.5μg/mL尼罗蓝溶液，10-30g/L餐厨废油脂和2％琼脂粉，高温121℃灭菌21min、冷却凝固后即获得筛选培养基；其中尼罗蓝溶液为1g尼罗蓝溶解于100mL二甲基亚砜中，充分溶解后即为尼罗蓝溶液。


3.如权利要求2所述产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3的筛选方法，其特征在于，所述餐厨废油脂为煎炸废油脂，蒸煮废油脂，地沟油，潲水油，餐厨垃圾处理后分离得到的混合废油脂，植物、动物提取的废弃油脂或者上述任意两种或者两种以上的混合。


4.一种如权利要求1所述产碱假单胞菌Pseudomonassp.H3的用途。


5.如权利要求1所述用途，其特征在于，所述用途是指用于将餐厨废油脂合成聚羟基脂肪酸酯的用途。


6.如权利要求1所述用途，其特征在于，所述餐厨废油脂为煎炸废油脂，蒸煮废油脂，地沟油，潲水油，餐厨垃圾处理后分离得到的混合废油脂，植物、动物提取的废弃油脂或...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘兰佳，汪印，李杰，林清怀，
申请(专利权)人：中国科学院城市环境研究所，厦门产业技术研究院，
类型：发明
国别省市：福建;35