一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，通过OptiPrep密度梯度离心法，分离、纯化得到了坏死杆菌外膜囊泡；通过蛋白质组学对纯化的坏死杆菌外膜囊泡成分进行了鉴定与分析，结果显示分离纯化的坏死杆菌OMVs直径为120nm左右，成分以坏死杆菌外膜蛋白43K OMP为主，包含有白细胞毒素等163个蛋白质；通过动物实验证明OMVs能诱导小鼠产生特异性免疫反应，对坏死杆菌A25菌株感染具有100％的免疫保护作用，表明坏死杆菌OMVs具备疫苗候选抗原的潜质，可以用于坏死杆菌高效疫苗的开发。

【技术实现步骤摘要】
一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法
本专利技术属于坏死杆菌制备疫苗抗原的
，具体涉及一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法。
技术介绍
坏死杆菌(Fusobacteriumnecrophorum)主要是引起牛、羊、猪等多种动物和人坏死性、化脓性疾病的一种人畜共患病病原；在坏死杆菌病中，坏死杆菌病最为严重，主要表现为奶牛腐蹄病和肉牛肝脓肿，引起巨大的经济损失；奶牛腐蹄病平均发病率为10％-20％左右，最高可达到50％，严重影响奶牛的生产性能和产奶质量；牛肝脓肿发病率从1％-95％不等，平均发病率为12％-32％左右，主要危害育成肉牛；近年研究发现，坏死杆菌参与奶牛乳房炎和子宫内膜炎的发生；因此，坏死杆菌在牛临床感染性疾病中扮演着越来越重要的角色，日趋成为热点问题；坏死杆菌属于梭杆菌属、是革兰阴性、杆状、无鞭毛，不形成芽胞和荚膜的一种严格厌氧性细菌；坏死杆菌在自然界的分布极为广泛，是一个以继发感染为主的病原，防控十分困难！随着耐药菌株、抗生素残留和灭活疫苗副作用等问题的出现，新型高效疫苗成为坏死杆菌病有效防治措施的研究热点；外膜囊泡(Outermembranevesicles，OMVs)是由革兰氏阴性菌分泌的球形、双层膜状结构，其直径在20-250nm之间，是一种自然不可复制的、高度免疫原性球形纳米颗粒；外膜囊泡的成分以细菌外膜蛋白为主，同时包括周质蛋白、内膜蛋白、细胞壁成分、细胞质成分、毒力因子、DNA、RNA、离子、代谢物和信号分子等成分，具有抗生素抵抗、刺激生物膜形成、传输生物分子、调控应激反应、调节免疫应答、调节微生物稳态、递送致病因子等重要的生物学功能；研究表明，流感嗜血杆菌OMVs能诱导小鼠产生黏膜免疫和体液免疫反应，对异源的流感嗜血杆菌感染具有保护作用；脆弱类杆菌OMVs释放的荚膜多糖，具有免疫调节作用，能预防结肠炎；布鲁氏菌OMVS能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫应答，显著增强Th1型细胞免疫反应；B型脑膜炎奈瑟球菌OMVs疫苗已经在多个国家和地区被广泛应用；OMVS作为疫苗抗原对土拉菌亚种、假性伯克霍尔德菌和溶血性曼氏菌等人类病原菌具有免疫保护作用；由此可见，OMVs以其稳定的纳米颗粒结构，同时包含细菌多种抗原蛋白，使其成为疫苗抗原候选靶标，是目前细菌新型高效疫苗研究的热点；目前，关于坏死杆菌OMVs作为疫苗抗原等相关研究未见报道，而如果能将坏死杆菌OMVs作为疫苗抗原应用于疾病防治中，可以极大程度的对坏死杆菌OMVs进行利用，将是细菌新型高效疫苗研究的一个福音。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术旨在提供一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，包括坏死杆菌A25菌株的培养、坏死杆菌OMVs的离心、分离、纯化等步骤，通过动物的特异性免疫实验证明了坏死杆菌OMVs能诱导小鼠产生特异性免疫反应，对坏死杆菌A25菌株感染具有100％的免疫保护作用，证明坏死杆菌OMVs具备疫苗候选抗原的潜质。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，包括以下步骤：S1.培养坏死杆菌将坏死杆菌A25菌株接于苛氧肉汤液体培养基中复苏，在37℃，90％N2、5％CO2、5％H2的厌氧培养箱内静置培养，传2-3代后作为种子液以1:25的比例转接于脑心浸液肉汤液体培养基中，在OD600值为0.7-0.9时收获菌液，得到培养后的坏死杆菌；S2.提取和纯化坏死杆菌外膜囊泡将步骤一培养的坏死杆菌进行离心、收集上清液、过滤、稀释等步骤提取得到纯化后的坏死杆菌外膜囊泡；S3.坏死杆菌外膜囊泡组分分析与鉴定采用Label-free非标记定量蛋白质组学方法分析坏死杆菌外膜囊泡的成分，得到蛋白质鉴定及定量分析结果；S4.对得到的坏死杆菌外膜囊泡进行特异性免疫实验。优选的，步骤S2所述的提取和纯化OMVs的具体步骤为：S2.1将坏死杆菌菌液在4℃，8500×g，离心15min，收集离心后的上清液，将收集的上清液用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液；S2.2将滤液移至无菌超速离心管中，在4℃，213000×g，离心2h，弃去上清液，将沉淀用无菌PBS悬浮；S2.3用pH7.4含有10mMTricine-NaOH的0.85％NaCl溶液，将60％OptiPrep稀释至35％、30％、25％、20％，用悬浮的坏死杆菌外膜囊泡将60％OptiPrep稀释到浓度为40％，取40％OptiPrep稀释液置于Ultra-Clear离心管底部，依次向上加入浓度为35％、30％、25％、20％的OptiPrep稀释液，并在4℃，135000×g，离心16h；S2.4离心后，从上至下依次吸取不同浓度的OptiPrep稀释液，然后从中取10μL不同浓度的OptiPrep稀释液进行SDS-PAGE，分析不同浓度的OptiPrep稀释液中坏死杆菌外膜囊泡的含量，不同浓度OptiPrep稀释液的SDS-PAGE结果显示，随着OptiPrep稀释液浓度的增加，条带变浅；S2.5用无菌PBS将不同浓度的OptiPrep稀释液稀释至少十倍，并在4℃，200500×g，离心2h，去除上清液，将离心后沉淀重悬于无菌PBS中，-80℃保存备用，进行透射电子显微镜观察。优选的，步骤S3所述的坏死杆菌外膜囊泡组分分析与鉴定的包括采用Label-free非标记定量蛋白质组学方法分析坏死杆菌外膜囊泡的成分分析过程S3.1和坏死杆菌外膜囊泡中43KOMP和lktA的WesternBlot验证过程S3.2。优选的，所述的采用Label-free非标记定量蛋白质组学方法分析坏死杆菌外膜囊泡的成分分析过程S3.1的具体步骤包括：S3.1.1蛋白质提取和肽段的酶解抽取坏死杆菌外膜囊泡样品，样品采用SDT裂解法提取蛋白质，然后采用BCA法进行蛋白质定量；每个样品取适量蛋白质采用Filteraidedproteomepreparation(FASP)方法进行胰蛋白酶酶解，然后采用C18Cartridge对酶解肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μLDissolutionbuffer复溶，肽段定量(OD280)；S3.1.2LC-MS/MS数据采集酶切后样品采用纳升流速HPLC液相系统EasynLC进行分离；样品由自动进样器上样到上样柱，再经分析柱分离，流速为250nl/min；样品经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析；S3.1.3蛋白质鉴定和定量分析用Maxquant软件检索相应数据库，得到蛋白质鉴定及定量分析结果；S3.1.4生物信息学分析利用软件Omicsbean对目标蛋白质集合进行GO功能注释和KEGG通路注释，结果显示：坏死杆菌外膜囊泡组分由细菌外膜蛋白、细菌毒素、ABC转运蛋白、自转运蛋白等蛋白质组成，其中包括43KOMP和lktA。优选的，所述的坏死杆菌外膜囊泡中43KOMP和lktA的WesternBlot验证过程本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.培养坏死杆菌/n将坏死杆菌A25菌株接于苛氧肉汤液体培养基中复苏，在37℃，90％N

【技术特征摘要】
1.一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.培养坏死杆菌
将坏死杆菌A25菌株接于苛氧肉汤液体培养基中复苏，在37℃，90％N2、5％CO2、5％H2的厌氧培养箱内静置培养，传2-3代后作为种子液以1:25的比例转接于脑心浸液肉汤液体培养基中，在OD600值为0.7-0.9时收获菌液，得到培养后的坏死杆菌；
S2.提取和纯化坏死杆菌外膜囊泡
将步骤一培养的坏死杆菌进行离心、收集上清液、过滤、稀释等步骤提取得到纯化后的坏死杆菌外膜囊泡；
S3.坏死杆菌外膜囊泡组分分析与鉴定
采用Label-free非标记定量蛋白质组学方法分析坏死杆菌外膜囊泡的成分，得到蛋白质鉴定及定量分析结果；
S4.对得到的坏死杆菌外膜囊泡进行特异性免疫实验。


2.根据权利要1所述的一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，其特征在于，步骤S2所述的提取和纯化OMVs的具体步骤为：
S2.1将坏死杆菌菌液在4℃，8500×g，离心15min，收集离心后的上清液，将收集的上清液用0.22μm的滤膜过滤，收集滤液；
S2.2将滤液移至无菌超速离心管中，在4℃，213000×g，离心2h，弃去上清液，将沉淀用无菌PBS悬浮；
S2.3用pH7.4含有10mMTricine-NaOH的0.85％NaCl溶液，将60％OptiPrep稀释至35％、30％、25％、20％，用悬浮的坏死杆菌外膜囊泡将60％OptiPrep稀释到浓度为40％，取40％OptiPrep稀释液置于Ultra-Clear离心管底部，依次向上加入浓度为35％、30％、25％、20％的OptiPrep稀释液，并在4℃，135000×g，离心16h；
S2.4离心后，从上至下依次吸取不同浓度的OptiPrep稀释液，然后从中取10μL不同浓度的OptiPrep稀释液进行SDS-PAGE，分析不同浓度的OptiPrep稀释液中坏死杆菌外膜囊泡的含量，不同浓度OptiPrep稀释液的SDS-PAGE结果显示，随着OptiPrep稀释液浓度的增加，条带变浅；
S2.5用无菌PBS将不同浓度的OptiPrep稀释液稀释至少十倍，并在4℃，200500×g，离心2h，去除上清液，将离心后沉淀重悬于无菌PBS中，-80℃保存备用，进行透射电子显微镜观察。


3.根据权利要2所述的一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，其特征在于，步骤S3所述的坏死杆菌外膜囊泡组分分析与鉴定的包括采用Label-free非标记定量蛋白质组学方法分析坏死杆菌外膜囊泡的成分分析过程S3.1和坏死杆菌外膜囊泡中43KOMP和lktA的WesternBlot验证过程S3.2。


4.根据权利要3所述的一种分离、提纯及鉴定坏死杆菌外膜囊泡的方法，其特征在于，所述的采用Label-free非标记定量蛋白质组学方法分析坏死杆菌外膜囊泡的成分分析过程S3.1的具体步骤包括：
S3.1.1蛋白质提取和肽段的酶解
抽取坏死杆菌外膜囊泡样品，样品采用SDT裂解法提取蛋白质，然后采用BCA法进行蛋白质定量；每个样品取适量蛋白质采用Filteraidedproteomepreparation方法进行胰蛋白酶酶解，然后采用C18Cartridge对酶解肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μLDissolutionbuffer复溶，肽段定量；
S3.1.2LC-MS/MS数据采集
酶切后样品采用纳升流速HPLC液相系统EasynLC进行分离；样品由自动进样器上样到上样柱，再经分析柱分离，流速为250nl/min...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙东波，郭东华，赵鹏宇，李春秋，蒋剑成，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23