一种改良的生产外膜囊泡的方法技术

本发明专利技术涉及医学微生物学和疫苗学领域。具体地，本发明专利技术涉及一种方法，其中通过应用高于生理溶解氧张力(DOT)的DOT来刺激革兰氏阴性细菌的细菌外膜囊泡(OMV)的自发释放。如此产生的OMV用于疫苗。本发明专利技术进一步涉及通过所述方法可获得的OMV，并且涉及包含这种OMV的药物组合物。本发明专利技术进一步涉及本发明专利技术的OMV作为药物的用途，特别是用于引发免疫应答的方法中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种改良的生产外膜囊泡的方法
本专利技术涉及医学微生物学和疫苗学领域。具体地，本专利技术涉及一种生产用于疫苗的革兰氏阴性细菌自发性(spontaneous)外膜囊泡(OMV)的方法、可由所述方法获得的OMV以及包含这种OMV的药物组合物。本专利技术还涉及本专利技术的OMV作为药物的用途(特别是用于引发免疫应答的方法中)。
技术介绍
外膜囊泡(OMV)由革兰氏阴性细菌天然产生，参与致病、细胞间通讯以及应激反应(KulpandKuehn2010)。最近的研究表明，革兰氏阳性细菌和古细菌(archaea)中也有膜囊泡形成(Ellenetal.2009；Riveraetal.2010)。OMV是球状纳米颗粒，囊泡由含有蛋白质和脂多糖(LPS)的磷脂双层组成，囊泡腔包含细菌的周质组分(KulpandKuehn2010；SchwechheimerandKuehn2015)。由于OMV与细菌的外膜高度类似、不复制，且特征性地充满病原体相关分子模式，因此，这些囊泡已成功用作疫苗(GorringeandPajon2012；Holstetal.2009)。这些疫苗已通过从细菌外膜提取囊泡来生产。通过这种方式，可使LPS脱毒并人工形成囊泡(Fredriksenetal.1991；Zollingeretal.1979)。但是，囊泡提取是不利的，因为研究发现，提取的OMV(eOMV)的蛋白质组与自发性OMV(sOMV)的蛋白质组之间存在差异(Lappannetal.2013；vandeWaterbeemdetal.2013a)。此外，对于脱毒来说，提取方法不再是必要的，因为可以采用分子脱毒(vanderLeyetal.2001)，分子脱毒是使用自发释放OMV的基础。自发释放囊泡的使用简化了OMV的纯化，因为它无需疫苗制品下游处理中的提取步骤(Lappannetal.2013；vandeWaterbeemdetal.2013a)。可行的sOMV生产一直都不明确。虽然在过去40年开展了关于OMV的研究，但是，触发细菌释放OMV的确切机制仍然未知。由于OMV的组成与细菌外膜不同，因此，通常认为囊泡的释放不是一个随机的过程(Schwechheimeretal.2013)。虽然仍不清楚是否存在共同的机制，但是有几种模型描述了OMV的生物发生(biogenesis)。OMV的生物发生被假定为基于周质中小肽聚糖积累、外膜对肽聚糖层的锚定减少，或O抗原电荷排斥。这些模型在(Hauratetal.2015)和(SchwechheimerandKuehn2015)中进行了综述。脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)的sOMV产生可通过使将外膜锚定到肽聚糖层的rmpM基因缺失而增加(vandeWaterbeemdetal.2010)。已利用减少外膜和肽聚糖层之间的连接来提高大肠杆菌(E.coli)的sOMV产生(Bernadacetal.,JBacteriol.1998,180(18):4872-8)。VandeWaterbeemdetal.(2013b)最近的工作表明，半胱氨酸耗竭触发脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)释放OMV。VandeWaterbeemd等人表明，半胱氨酸耗竭触发的OMV释放可能是通过半胱氨酸耗竭引起的氧化应激而介导。事实上，由添加至培养基的过氧化物的脉冲诱导的氧化应激具有类似但短暂的效果，因为每次添加过氧化物后，sOMV会被暂时的释放。然而，对于可规模化的OMV生产方法来说，加入过氧化氢是不可行的，因为将过氧化氢添加到细菌培养物中会导致显著的细胞死亡和细菌裂解。因此，仍然需要更高效的、可规模化的生产sOMV的方法。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术涉及一种生产自发释放的细菌外膜囊泡(OMV)的方法，其中该方法包括以下步骤：a)培养革兰氏阴性细菌菌群，该培养包括通过应用溶解氧张力(DOT)来刺激OMV的释放，所述溶解氧张力(DOT)高于在35℃测量的30％空气饱和度的生理DOT；以及，b)回收a)中释放的OMV，其中该回收至少包括从OMV中除去细菌。优选地，在该方法中，应用来刺激OMV释放的DOT为在35℃测量的至少31％、32％、35％、40％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％或200％空气饱和度，并且其中优选地，应用来刺激OMV释放的DOT低于在35℃测量的350％、325％、300％、275％、250％、225％、205％或185％空气饱和度。本专利技术的一种方法优选是这样一种方法，其中培养革兰氏阴性细菌包括采用添加补料培养基(feedingmedium)的模式，其中所述模式选自补料分批模式、半连续模式和连续模式。更优选地，该方法包括：a)第一阶段，其中革兰氏阴性细菌的生物质在第一DOT积累；以及，b)第二阶段，其中通过应用比第一DOT高的第二DOT来刺激OMV从a)中积累的生物质释放；其中优选地，第一DOT是生理DOT，优选低于在35℃测量的50％、40％、35％或32％空气饱和度的DOT。在本专利技术的方法中，革兰氏阴性细菌优选具有以下至少一项：a)遗传修饰，该遗传修饰使细菌产生具有减少的毒性的LPS但LPS仍保留至少部分的其佐剂活性；优选地，所述遗传修饰是降低或敲除选自lpxL1和lpxL2基因或其同源物和lpxK基因或其同源物的一个或多个基因的表达的修饰，和/或所述遗传修饰是引起一个或多个lpxE和/或pagL基因表达的修饰；b)遗传修饰，该遗传修饰使该细菌与没有该遗传修饰的相应野生型细菌相比过量生产OMV，其中该遗传修饰是减弱包含肽聚糖相关位点的一种或多种蛋白的肽聚糖结合活性的修饰，优选地，所述遗传修饰是降低或敲除选自tolQ、tolR、tolA、tolB、tolRA、rmpM和ompA基因的一个或多个基因的表达的修饰；以及，c)遗传修饰，该遗传修饰降低或敲除基因产物的表达，优选地，基因产物选自cps、脂质A生物合成基因产物、PorA、PorB和OpA。革兰氏阴性细菌优选属于选自奈瑟球菌属(Neisseria)、博德特菌属(Bordetella)、螺杆菌属(Helicobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、弧菌属(Vibrio)、志贺菌属(Shigella)、嗜血菌属(Haemophilus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、莫拉菌属(Moraxella)、克雷伯菌属(Klebsiella)和不动杆菌属(Acinetobacter)的属；优选地，该细菌是选自脑膜炎奈瑟球菌、乳酰胺奈瑟球菌(Neisserialactamica)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、志贺菌属物种(Shigellaspp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产自发释放的细菌外膜囊泡(OMV)的方法，其中所述方法包括以下步骤：/na)培养革兰氏阴性细菌菌群，所述培养包括通过应用比在35℃测量的30％空气饱和度的生理溶解氧张力(DOT)高的DOT来刺激OMV释放；以及，/nb)回收a)中释放的所述OMV，其中所述回收至少包括从所述OMV中除去细菌。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171204 EP 17205138.51.一种生产自发释放的细菌外膜囊泡(OMV)的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)培养革兰氏阴性细菌菌群，所述培养包括通过应用比在35℃测量的30％空气饱和度的生理溶解氧张力(DOT)高的DOT来刺激OMV释放；以及，
b)回收a)中释放的所述OMV，其中所述回收至少包括从所述OMV中除去细菌。


2.根据权利要求1所述的方法，其中应用来刺激OMV释放的DOT为至少在35℃测量的31％、32％、35％、40％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％或200％空气饱和度，以及其中优选地，应用来刺激OMV释放的DOT低于在35℃测量的350％、325％、300％、275％、250％、225％、205％或185％空气饱和度。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述培养包括采用添加补料培养基的模式，其中所述模式选自补料分批模式、半连续模式和连续模式。


4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述方法包括：
a)第一阶段，其中所述革兰氏阴性细菌的生物质在第一DOT积累；以及，
b)第二阶段，其中通过应用比第一DOT高的第二DOT来刺激OMV从a)中积累的生物质中释放；
其中优选地，所述第一DOT是生理DOT，优选是低于在35℃测量的50％、40％、35％或32％空气饱和度的DOT。


5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌具有以下至少一项：
a)遗传修饰，所述遗传修饰使所述细菌产生具有减少的毒性的LPS但LPS仍保留至少部分的其佐剂活性；优选地，所述遗传修饰是降低或敲除选自lpxL1和lpxL2基因或其同源物和lpxK基因或其同源物的一个或多个基因的表达的修饰，和/或所述遗传修饰是引起一个或多个lpxE和/或pagL基因表达的修饰；
b)遗传修饰，所述遗传修饰使所述细菌与没有所述遗传修饰的相应野生型细菌相比过量生产OMV，其中所述遗传修饰是减弱包含肽聚糖相关位点的一种或多种蛋白的肽聚糖结合活性的修饰，优选地，所述遗传修饰是降低或敲除选自tolQ、tolR、tolA、tolB、tolRA、rmpM和ompA基因的一个或多个基因的表达的修饰；以及，
c)遗传修饰，所述遗传修饰降低或敲除基因产物的表达，优选地，基因产物选自cps、脂质A生物合成基因产物、PorA、PorB和OpA。


6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·J·H·格里岑，L·A·范德波尔，M·施托克，
申请(专利权)人：由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL