包含具有降低的反应原性的LPS的博德特氏菌疫苗制造技术

本发明专利技术属于医学领域，更特别属于疫苗学领域。本发明专利技术涉及一种新的博德特氏菌(Bordetella)LPS及包含这种修饰的LPS的博德特氏菌属的修饰的细菌。与未修饰的博德特氏菌LPS相比，本发明专利技术的LPS具有降低的内毒性。因此，本发明专利技术的经修饰的LPS特别适用于诱导或刺激受试者的免疫应答，其中针对博德特氏菌感染诱导或刺激免疫应答。本发明专利技术的修饰的博德特氏菌LPS可通过在博德特氏菌细胞中导入异源酰基转移酶的表达而获得。特别地，本发明专利技术的修饰的博德特氏菌细胞具有增加的异源LpxA、LpxL或LpxD酰基转移酶的表达。

Bordetella vaccine containing LPS with reduced reactivity

The invention belongs to the field of medicine, in particular to the field of vaccinology. The invention relates to a new Bordetella LPS and a modified bacterium of Bordetella containing the modified LPS. Compared with unmodified LPS of Bordetella, the LPS of the invention has lower internal toxicity. Therefore, the modified LPS of the invention is particularly suitable for inducing or stimulating the immune response of the subject, in which the immune response is induced or stimulated against the infection of Bordetella. The modified LPS of Bordetella can be obtained by introducing heteroacyltransferase expression into Bordetella cells. In particular, the modified Bordetella cells of the present invention have increased heterologous LpxA, lpxl or lpxd acyltransferase expression.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含具有降低的反应原性的LPS的博德特氏菌疫苗专利
本专利技术属于疫苗学领域，特别是预防或治疗博德特氏菌(Bordetella)感染的领域。本专利技术涉及具有降低的内毒性的博德特氏菌LPS，以及包含这种修饰的LPS的博德特氏菌属的遗传修饰细菌。本专利技术进一步涉及可得自所述修饰的细菌的外膜囊泡(OMV)。本专利技术还涉及包含所述LPS、遗传修饰的细菌和/或OMV的组合物以及所述组合物作为药物的用途。本专利技术进一步涉及用于治疗的所述组合物，包括在受试者中诱导或刺激免疫应答。
技术介绍
百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)是一种革兰氏阴性菌及是一种专性人类病原体，导致百日咳，这是一种急性呼吸道疾病，也称为顿咳。已经开发了针对百日咳的一些疫苗制剂。在上个世纪五十年代引入的全细胞百日咳疫苗是有效的，但产生了不可接受的副作用。因此，其目前已退出工业化国家的市场。基于亚单位的疫苗取代了全细胞疫苗，因为其被证明是安全的并且赋予对该疾病的相对保护(55-95％的覆盖)。然而，病原体的快速适应和免疫力的迅速减弱等降低了这些制剂的功效。在过去几十年中，工业化国家的情况特别令人担忧，其中包括免疫接种者在内的病例数量大幅增加[1]。因此，对新的、安全的和有效的疫苗制剂具有强烈的医学需求。实现这一目标的策略可以是引入毒性降低的新型全细胞疫苗。由于毒性主要由脂多糖(LPS)的脂质A部分决定[2]，因此这种方法需要脂质A工程化。LPS是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。其由脂质A部分、核心寡糖和称为O-抗原的长多糖组成，然而在包括百日咳博德特氏菌在内的一些菌种中缺乏这种多糖[3-5]。脂质A部分由哺乳动物LPS受体TLR4/MD-2复合物识别，导致结束于促炎细胞因子和趋化因子的产生的信号传导级联的激活[6]。这些介质可激活免疫防御[7，8]，但过度刺激会导致具有致命后果的多种失调[9]。因此，LPS可以作为佐剂，也可以作为有效的内毒素。大肠杆菌(Escherichiacoli)的脂质A由葡糖胺二糖组成，其在1和4′位置被磷酸化并含有四个羟基化脂肪酰基链，通过酰胺键连接到2和2′位置及通过酯键连接到3和3′位置。两个仲酰基链在2′和3′位置被酯化成脂肪酸的羟基[4]。脂质A的生物合成途径需要9种保守的酶[4]。在第一步中，通过LpxA将3-羟基酰基链从酰基载体蛋白转移至活化的糖UDP-GlcNAc中N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的位置3[10，11]。然后通过LpxC将所得产物脱乙酰化，随后通过LpxD在位置2用3-羟基酰基链酰化。然后LpxH将UMP分子从所得分子一部分中除去，及一个修饰的分子通过LpxB与未修饰的分子连接。通过LpxK将所得产物在4′位置磷酸化以产生四酰化和二磷酸化的脂质IVA。然后通过WaaA将两个3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)残基加入6′位置，之后通过LpxL和LpxM酰基转移酶加入仲酰基链。在不同的细菌物种中发现脂质A结构的变化。这些变化影响LPS受体的活化。特别地，酰基链的数量和长度以及磷酸基团的数量均可以决定活化强度[4，12，13]。酰基链长度的变化由酰基转移酶LpxA、LpxD、LpxL和LpxM中的分子标尺决定，其在不同细菌物种的这些酶之间变化[14]。此外，在保守的生物合成途径之后，可以通过位于内膜或外膜中的酶在脂质A中在其被转运至外膜期间或之后导入修饰。这些修饰包括酰化、去酰化和去磷酸化，细菌物种之间这些酶的存在不同[15]。百日咳博德特氏菌的脂质A(图1A)与大肠杆菌的脂质不同之处在于其是五酰化的：其错失与3′位置的伯酰基链(primaryacylchain)连接的仲酰基链(secondaryacylchain)。此外，剩余仲酰基链是C14而不是大肠杆菌中发现的C12，奇怪的是在3和3′位置的伯羟基化酰基链的长度不同(图1A)，即使其是通过相同LpxA酶加入的。先前报道了博德特氏菌3-O-脱酰基的LPS降低LPS毒性(见例如WO2006/065139)。然而，在3位置失去伯酰基链的百日咳博德特氏菌LPS的毒性降低由于其从膜上释放的增加而在全细胞制剂中无效[2]。因此，本领域仍然强烈需要具有降低的内毒性的博德特氏菌LPS。特别地，需要具有这种具有降低的内毒性的LPS的博德特氏菌物种。优选地，LPS的内毒性足够低以适用于预防或治疗博德特氏菌感染。更确切地说，本领域仍然需要包含具有降低的内毒性的LPS的全细胞博德特氏菌疫苗。专利技术概述第一方面，本专利技术涉及具有脂质A部分的博德特氏菌LPS，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰为至少一个酰基链的长度更短。优选地，在修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度与野生型博德特氏菌脂质A部分在相同3位置的酰基链相比不具有更长的长度，及优选在修饰的脂质A部分的3位置的酰基链长度不大于C10。优选地，修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度与野生型博德特氏菌脂质A部分在相同3位置的酰基链具有相同长度，优选在3位置的酰基链长度为C10。在本专利技术的一个优选实施方案中，修饰的脂质A部分的3位置的酰基链长度与3′位置的酰基链长度相同。优选地，较短的酰基链选自：i)脂质A部分的3′位置的酰基链；ii)脂质A部分2′位置的伯酰基链；iii)脂质A部分2′位置的仲酰基链；及iv)脂质A部分2位置的酰基链。优选地，所述酰基链短至少2个、4个或6个C原子。在进一步优选的实施方案中，本专利技术涉及如本文定义的博德特氏菌LPS，其中除了修饰的脂质A部分外，LPS具有百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌(Bordetellaparapertussis)或支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)的结构。优选地，除了修饰的脂质A部分之外，LPS具有百日咳博德特氏菌的结构。在进一步优选的实施方案中，本专利技术涉及如本文定义的博德特氏菌LPS，其中所述修饰的脂质A部分具有式(I)的结构：其中X2、X3、X2’、X3’、R2、R3、R2’和R3’均独立地选自-H、-OH、-Y、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y和-O-(C＝O)-Y，其中Y是通式-(CH2)n-H的烷基部分，n对于Y的每种情况均是独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数。第二方面，本专利技术涉及博德特氏菌属的遗传修饰的细菌，其中所述细菌包含如本文定义的LPS。优选地，所述细菌与野生型博德特氏菌相比被修饰为具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰。优选地，导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰赋予细胞至少一种异源LpxA、LpxL和LpxD酰基转移酶活性。优选地，遗传修饰导入至少一种异源lpxA、lpxL和lpxD基因的表达，其中i)lpxA基因具有编码与SEQIDNO：1具有至少60％氨基酸序列相同性的LpxA酰基转移酶的核苷酸序列；ii)lpxL基因具有编码与SEQIDNO：2具有至少60％氨基酸序列相同性的LpxL酰基转移酶的核苷酸序列；和/或iii)lpxD本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种博德特氏菌(Bordetella)LPS，其具有脂质A部分，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰成至少一个酰基链的长度较短。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170313 EP 17160604.91.一种博德特氏菌(Bordetella)LPS，其具有脂质A部分，所述脂质A部分与野生型博德特氏菌LPS的脂质A部分相比被修饰成至少一个酰基链的长度较短。


2.权利要求1的博德特氏菌LPS，其中所述被修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度不具有比在野生型博德特氏菌脂质A部分在相同3位置的酰基链更长的长度，其中优选所述被修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度不大于C10，其中更优选所述被修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度具有与野生型博德特氏菌脂质A部分在相同3位置的酰基链相同的长度，且优选在3位置的酰基链长度为C10。


3.权利要求1或2的博德特氏菌LPS，其中在所述被修饰的脂质A部分的3位置的酰基链的长度与在3'位置的酰基链的长度相同。


4.权利要求1-3任一项的博德特氏菌LPS，其中所述较短的酰基链选自：
i)所述脂质A部分的3'位置的酰基链；
ii)所述脂质A部分的2'位置的伯酰基链；
iii)所述脂质A部分的2'位置的仲酰基链；及
iv)所述脂质A部分的2位置的酰基链。


5.权利要求1-4任一项的博德特氏菌LPS，其中所述酰基链短至少2、4或6个C原子，
和/或，其中除了所述修饰的脂质A部分之外，所述LPS具有百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetellaparapertussis)或支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)的结构，其中优选除了所述修饰的脂质A部分之外，所述LPS具有百日咳博德特氏菌的结构，
和/或，其中所述修饰的脂质A部分具有式(I)的结构：



其中X2、X3、X2’、X3’、R2、R3、R2’和R3’各自独立地选自-H、-OH、-Y、-O-(C＝O)-CH(OH)-Y和-O-(C＝O)-Y，其中Y是通式-(CH2)n-H的烷基部分，且n对于Y的每种情况均是独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的整数。


6.一种遗传修饰的博德特氏菌属细菌，其中所述细菌包含权利要求1-5任一项定义的LPS。


7.权利要求6的遗传修饰的细菌，其中与野生型博德特氏菌属细菌相比，所述细菌被修饰成具有导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰，
其中优选所述导入异源酰基转移酶活性的遗传修饰赋予细胞异源LpxA、LpxL和LpxD酰基转移酶活性中的至少一种，
及其中更优选所述遗传修饰导入异源lpxA、lpxL和lpxD基因中...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·A·范德莱，J·A·阿雷纳斯布斯托，E·普波埃斯卡洛纳，J·P·M·托马森，
申请(专利权)人：由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL