临床个体化肿瘤新抗原的预测方法技术

本发明专利技术涉及预测技术，解决了现有肿瘤新抗原分析无法采用一步法获得最后结果及根据临床结果的反馈提升预测的准确率的缺点，提供了一种临床个体化肿瘤新抗原的预测方法，其技术方案可概括为：将患者肿瘤细胞的测序数据与对应参考基因组进行比对得到DNA及RNA比对结果，进行预处理后分析肿瘤细胞中的体细胞变异、克隆类型、肿瘤纯度、肿瘤细胞中的基因表达量及体细胞变异等位基因表达丰度，得到分析结果，再分析潜在新抗原的亲和性及计算多肽递呈效力，根据分析结果、潜在新抗原的亲和性及多肽递呈效力对各对应的新抗原进行评分及排序后呈现。其有益效果是，标准化的过程可提高准确性，且具有更便捷的操作性及可重复性，适用于临床个体化肿瘤新抗原的预测。

【技术实现步骤摘要】
临床个体化肿瘤新抗原的预测方法
本专利技术涉及预测技术，特别涉及个体化肿瘤新抗原的预测技术。
技术介绍
肿瘤的免疫治疗被认为是继手术、放疗、化疗和小分子靶向治疗之后的新一代肿瘤治疗方法，它与之前传统治疗方法的不同之处在于：免疫治疗将治疗手段从直接药物杀伤肿瘤细胞的思路转变为激活免疫细胞，通过增强患者自身的抗肿瘤免疫能力来治疗肿瘤，与传统治疗相比具有杀伤精准、副作用小、疗效持久及个性化程度高等优势。此外，机体免疫系统具有免疫记忆的特性，因此免疫治疗可以帮助患者形成记忆型免疫，在防止肿瘤复发和转移上具有显著优势。目前免疫治疗主要分为两类：基于免疫检查点抑制剂的免疫治疗和细胞免疫治疗。免疫检查点抑制剂已经有多种上市的药物(包括施贵宝和默克公司的PD-1抑制剂等)，在晚期肿瘤的治疗中已经取得了显著的成效，特别是很多对传统疗法耐受的患者也能通过这种疗法获益。对部分肿瘤的治疗中该疗法已经作为一线治疗手段。但是该疗法的总体获益人群占总患者人群的比例约为10～30％，代表着仍然有大量的患者不能获益。细胞免疫治疗又称细胞过继免疫治疗，主要将病人的自身T细胞进行外界修饰或者刺激，让普通T细胞能够特异识别肿瘤细胞，从而对其进行攻击和杀伤。而作为细胞免疫治疗的代表，CAR-T已在血液肿瘤及部分实体瘤中取得了巨大的成功。然而对于实体瘤而言，免疫细胞治疗仍面临着很大的挑战，需要研发新的更有效的免疫治疗关键技术。T细胞特异识别肿瘤细胞的机制在于：肿瘤细胞中存在区别于正常细胞的基因突变，这些突变被翻译成蛋白质后有异于正常的蛋白，其中一些突变蛋白经过泛素化修饰和降解后形成的多肽能被免疫系统识别，称为多肽的抗原性，这些具有抗原性的多肽被肿瘤细胞自身的主要组织相容性复合体(MHC)递呈到细胞表面，继而被免疫系统识别为外来物，使得肿瘤细胞被免疫细胞攻击并杀伤。这类具有抗原性的突变蛋白也被称为叫肿瘤新抗原(neoantigen)。细胞过继免疫治疗根据其发展历程主要分为以下几类：自体淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、自体肿瘤浸润性淋巴细胞(TumorInfiltratingLymphocytes,TILs)、树突状细胞结合细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)、以及经基因修饰改造的T细胞(CAR-T)。CAR-T疗法通过修饰设计了特异针对某种抗原，目前在治疗B淋巴细胞白血病和淋巴瘤有较好的效果，但对实体瘤效果较差，主要是因为其能利用的肿瘤抗原较少且靶点单一。除CAR-T外，其他的细胞治疗均没有特殊设计的抗原，需要免疫细胞通过自然反应识别肿瘤的特殊抗原，因此这些疗法的受益人群并不多(约10％)，主要是因为肿瘤自身的抗原不足以激活免疫细胞。近期有临床研究发现将肿瘤细胞裂解物与免疫细胞进行共培养可以提高治疗效果，同时在患者体内检测到了特异识别肿瘤抗原的特殊T细胞，证明免疫系统通过识别肿瘤抗原来攻击肿瘤细胞。与此类似的是，美国国家癌症研究所外科分部的主任StevenRosenberg博士从切除的肿瘤或活检样本中提取出肿瘤浸润T淋巴细胞(这类细胞来源于肿瘤，是已知的能够识别和攻击癌症的免疫细胞)，挑选出抗肿瘤活性最强的细胞，进行体外增殖并输送回患者体内，该治疗方法取得了很好的疗效，在少数患者中甚至能使肿瘤完全消退。然而，这些方法都比较被动，因为很多患者的肿瘤细胞还不足以激活自身免疫系统，或者淋巴浸润T细胞数量太少达不到最终治疗要求，因此有效提高细胞治疗疗效的一个策略应当是主动寻找肿瘤新抗原，通过体外培养对免疫细胞进行高强度的抗原刺激，再将能特异识别肿瘤新抗原的细胞回输到患者体内用于攻击具有肿瘤新抗原的肿瘤细胞。在临床操作中，研究人员通常从肿瘤患者中抽取血细胞培养出成熟的DC细胞，然后用“突变抗原”刺激DC细胞，制备成DC疫苗。美国华盛顿大学的研究表明，使用该类DC疫苗可在晚期黑色素瘤患者的体内激发出有效的免疫反应，产生精准识别癌细胞的具有高杀伤活性的T细胞。国际大型的肿瘤基因组计划(TCGA)已经找到了大量不同肿瘤的体细胞突变并绘制成突变图谱，目前已经有研究开展了针对突变图谱中新抗原的分析和验证。不过值得特别注意的是，由于东西方人种之间的差异，以及肿瘤本身巨大的异质性的特点，基于欧美患者获得的肿瘤突变谱在我国病人中有可能不突变或是突变频率较低，而在我国属于高频突变的位点在西方人群中则可能未被报道；此外，决定突变是否有免疫原性的关键决定因素HLA位点变异在不同人种中也存在着巨大差异，提示我们需要对中国人群进行人种特异性的研究和分析。要主动找到肿瘤新抗原，必须具备两个条件：第一是能对每个患者个体肿瘤基因组进行高通量的DNA序列检测，以寻找所有的肿瘤特异性突变；另一方面则是对这些突变表达出来的蛋白和多肽进行抗原性预测，将潜在的新抗原肽段进行体外合成(这些肽段也被称为肿瘤疫苗)，最后使用高浓度和高强度的肿瘤疫苗激活免疫细胞。目前，针对肿瘤的新抗原免疫治疗已经有较好的理论和实践基础，主要体现在以下几方面：1、随着二代测序技术和生物信息学的发展，短时间大规模的测序和分析已经成为可能，目前对人基因组的全扫描只需要一周的时间，特别是还可以仅针对基因编码区进行全外显子测序，大大减少了测序量和分析的难度，使鉴定肿瘤内部所有突变的过程变得越来越简单。另一方面，针对肿瘤体细胞检测的软件已经非常成熟，能高效快速地辨别出肿瘤组织特有的体细胞突变。此外，肿瘤新抗原预测程序和软件的成功开发和应用也为我们寻找新抗原提供有力的工具。这些成熟的生物信息学分析方法和软件使得我们可以在一天内即完成病人的体细胞变异检测、HLA基因型预测、突变所在RNA的丰度计算、肿瘤克隆状态分析以及新抗原亲和性预测等工作，为临床治疗节约宝贵的时间。2、科学家长期以来立足于免疫学的基础研究，其中关于T细胞抗原识别的研究已经取得了长足的进展。研究发现在肿瘤中的某些变异蛋白在经过降解后形成的多肽(也被称为抗原表位)可以被MHC分子特异识别并形成MHC-抗原肽复合体，继而复合体被呈递到抗原递呈细胞的表面并被T细胞识别为非己成分，使得T细胞活化成效应T细胞而对肿瘤细胞进行攻击和清除，其中最为关键的步骤就是MHC分子与多肽分子的结合。人体内的MHC分子又称为人类白细胞抗原(HLA)，主要分为MHCI类分子和MHCII类分子，前者由大多数的细胞表达，主要参与内源抗原的递呈；而后者主要由抗原递呈细胞表达，主要参与外源抗原的递呈。其中人的基因组中存在三个编码MHCI(HLA-A、HLA-B和HLA-C)和三个MHCII的基因(HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP)，这些基因的变异非常大，目前已经发现有数万种不一样的基因型，不同的基因型一般对同一多肽有不同的亲和力，也就是识别其作为抗原的能力，亲和力越强则识别能力越强。3、截止目前为止，相关领域的科学家已经构建了多个抗原表位数据库并开发了多个抗原表位预测相关软件。IEDB数据库是由Peter等人开发能为用户提供预测以及相关注释的服务，包括抗原表位结合预测，基于细胞内存在的肽对抗原表位进行预测，以及对多肽/MHC复合物引发免疫应答的相对能力进行预测等等。目前抗原预测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.临床个体化肿瘤新抗原的预测方法，包括以下步骤：/n步骤1、将患者肿瘤细胞的测序数据与预设的对应参考基因组进行比对，得到DNA比对结果及RNA比对结果；/n步骤2、对DNA比对结果及RNA比对结果进行预处理；/n步骤3、利用DNA比对结果及RNA比对结果分析肿瘤细胞中的体细胞变异、克隆类型、肿瘤纯度、肿瘤细胞中的基因表达量及体细胞变异等位基因表达丰度，得到分析结果；/n步骤4、预测患者肿瘤细胞的MHC I类分子的基因型，并根据DNA分析结果及患者肿瘤细胞的MHC I类分子的基因型分析潜在新抗原的亲和性及计算多肽递呈效力；/n步骤5、根据分析结果、潜在新抗原的亲和性及多肽递呈效力对各对应的新抗原进行评分及排序后呈现。/n

【技术特征摘要】
1.临床个体化肿瘤新抗原的预测方法，包括以下步骤：
步骤1、将患者肿瘤细胞的测序数据与预设的对应参考基因组进行比对，得到DNA比对结果及RNA比对结果；
步骤2、对DNA比对结果及RNA比对结果进行预处理；
步骤3、利用DNA比对结果及RNA比对结果分析肿瘤细胞中的体细胞变异、克隆类型、肿瘤纯度、肿瘤细胞中的基因表达量及体细胞变异等位基因表达丰度，得到分析结果；
步骤4、预测患者肿瘤细胞的MHCI类分子的基因型，并根据DNA分析结果及患者肿瘤细胞的MHCI类分子的基因型分析潜在新抗原的亲和性及计算多肽递呈效力；
步骤5、根据分析结果、潜在新抗原的亲和性及多肽递呈效力对各对应的新抗原进行评分及排序后呈现。


2.如权利要求1所述的临床个体化肿瘤新抗原的预测方法，其特征在于，步骤1中，所述将患者肿瘤细胞的测序数据与预设的对应参考基因组进行比对中，采用Burrows-Wheeler转化算法得到DNA比对结果；采用STAR算法得到RNA比对结果。


3.如权利要求1所述的临床个体化肿瘤新抗原的预测方法，其特征在于，步骤1之前，还包括以下步骤：
步骤0、对患者肿瘤细胞的原始测序数据进行预处理，得到患者肿瘤细胞的测序数据。


4.如权利要求3所述的临床个体化肿瘤新抗原的预测方法，其特征在于，步骤0中，所述预处理包括修剪测序接头序列、修剪测序标签序列及去除测序质量较差的序列，采用Trimmomatic软件进行。


5.如权利要求1所述的临床个体化肿瘤新抗原的预测方法，其特征在于，步骤2中，所述预处理包括去重、添加组信息及碱基质量重计算，采用GATK软件进行。


6.如权利要求1所述的临床个体化肿瘤新抗原的预测方法，其特征在于，步骤3包括以下步骤：
步骤3A、利用DNA对比结果分析肿瘤细胞中的体细胞突变位点；
步骤3B、根据体细胞突变位点结合RNA比对结果分析得到体细胞变异等位基因表达丰度及肿瘤细胞中的基因表达量；
步骤3C、通过体细胞变异等位基因表达丰度过滤体细胞突变位点中的假阳性位点，得到实际体细胞突变位点；
步骤3D、对实际体细胞突变位点进行注释及进一步过滤，得到体细胞变异；
步骤3E、计算肿瘤的拷贝数变异文件；
步骤3F、根据体细胞变异及肿瘤的拷贝数变异文件计算肿瘤纯度及克隆结构；
步骤3G、根据RNA比对结果分析肿瘤细胞中的基因表达量。


7.如权利要求6所述的临床个体化肿瘤新抗原的预测方法，其特征在于，步骤3D中，所述体细胞变异是指：针对注释后的实际体细胞突变位点进行进一步过滤，仅保留外显子区域中非同义体细胞突变位点。


8.如权利要求6所述的临床个体化肿瘤新抗原的预测方法，其特征在于，步骤3A采用Mutect2软件进行分析；步骤3B采用GATK的HaplotyperCaller软件分析；步骤3C采用FilterMutectCalls软件进行分析；步骤3D采用ANNOVAR软件进行注释；步骤3E采用cnvkit软件进行计算；步骤3F中，所述计算肿瘤纯度采用ABSOULTE软件进行计算，所述克隆结构采用pyClone软件进行计算；所述克隆结构是指突变基因克隆比，即每个体细胞变异位点的克隆比例。


9.如权利要求6所述的临床个体化肿瘤新抗原的预测方法，其特征在于，步骤3G中，基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：许恒，舒洋，杨莉，丁振宇，魏于全，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51