腹泻性贝类毒素及其酯化态提取、筛查与质谱确证方法技术

本发明专利技术公开了一种腹泻性贝类毒素及其酯化态提取、筛查与质谱确证技术方法，包括下列步骤：（1）毒素提取：（2）毒素净化：（3）组合型四极杆Orbitrap高分辨液质联用仪测定：（4）定量分析和定性确证。本发明专利技术解决了腹泻性贝类毒素及其酯化态的系统检测问题。通过优化的前处理方法，可以实现多参数的高效率提取，提取率是保障筛查有效性的必要条件。应用系统的仪器筛查方法，最大限度的满足离子通过率及二级碎片的获取，同时达到高通量筛查和精准定性的目的。应用本方法进行的筛查工作，能最大限度的提高产品的腹泻性贝类毒素及其酯化态的质量安全筛查要求，保障消费者的质量安全。

【技术实现步骤摘要】
腹泻性贝类毒素及其酯化态提取、筛查与质谱确证方法
本专利技术涉及一种腹泻性贝类毒素及其酯化态提取、筛查与质谱确证方法，属于食品安全检测生物

技术介绍
腹泻性贝毒（DiarrheticShellfishPoisoning，DSP）是一类由海洋微藻产生的具有热稳定性的多环聚醚脂类次级代谢产物，目前其主要来源于原甲藻属和鳍藻属等有毒甲藻。DSP毒素在滤食性双壳贝类体内富集、代谢和转化，通过食物链传递到人体内，引起中毒事件的发生。DSP毒素主要包括大田软海绵酸（Okadaicacid,OA）、鳍藻毒素(Dinophytoxin-1,DTX-1；Dinophytoxin-2,DTX-2)，均属于游离态毒素。OA和DTXs是DSP毒素中分布范围最广和危害最大的一类毒素组分，是强烈的致癌因子和肿瘤促进因子。此类毒素是蛋白磷酸酶特异性抑制剂，可以有效的抑制丝氨酸和苏氨酸磷酸酶的活性，导致蛋白质过磷酸化，破坏细胞生物机能和导致细胞死亡，引起机体中毒。除此之外，酰化衍生物、硫酸酯类衍生物和二醇酯类衍生物是DSP在不同基质中的中间产物。尤其二醇酯类衍生物是OA母体离子C1位置被C6-C10含羟基的不饱和碳链酯化而来，种类繁多且在产毒藻中广泛分布。产毒藻被滤食性双壳贝类摄食，在体内蓄积代谢转化同时通过食物链传递到人体内产生及急性毒性作用，从而引起人类中毒。因此，酯化态毒素对食品安全、人类健康和生态环境具有潜在风险，受到发达国家和国际组织的重点关注。目前，腹泻性贝类毒素检测主要采用小鼠生物法、酶联免疫法及液相色谱串联质谱法。其中，液相色谱-串联质谱法结合了液相色谱的分离能力和质谱定性定量功能，具有较高的专属性、准确性、灵敏度和分析范围广的特点，提高了腹泻性贝毒的分析通量和检测效率，已成为腹泻性贝毒研究的首要检测手段。而由于酯化态毒素缺乏标准品给检测带来极大难度，缺乏从前处理、分析检测到精准定性分析的系统性检测方法。这极大地影响了对现有腹泻性贝类毒素及其酯化态毒素对水产品质量安全危害水平的评估，对产业发展和质量安全产生隐患。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种藻细胞中大田软海绵酸多种酯化态毒素的提取、筛查与质谱确证技术。本专利技术提供的腹泻性贝类毒素及其酯化态提取、筛查与质谱确证方法，包括下列步骤：（1）毒素提取：收集平台期藻细胞，加入毒素提取剂，毒素提取剂为甲醇水溶液；涡旋混合，超声提取、离心，移取上清液至离心管中，待净化；（2）毒素净化：用去离子水将提取液稀释，加载到StrataTM-X固相萃取柱上，保持一定的流速，收集滤出液、淋洗液和洗脱液，准确移取定体积以上三种溶液，氮气吹干，再用甲醇定容，高速离心，吸取上清液过0.2μm滤膜后得样品待测液；（3）组合型四极杆Orbitrap高分辨液质联用仪测定：根据不同正负离子扫描模式和碰撞能下各组分的裂解情况确定多级质谱条件参数，将已有标准溶液和待测样品进样依次测定，以标准溶液各组分的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归分析，利用峰面积归一化法测定酯化态毒素的相对近似含量；（4）定量分析和定性确证：采用组合型四极杆Orbitrap高分辨质谱的一级母离子全扫描加数据依赖的二级子离子扫描模式（FullMS/dd-MS2），设定涵盖目标化合物的质量数范围600-1500m/z进行一级全扫描，在扫描过程中，当一级全扫描发现已有标准溶液的母离子时，且信号强度超过预设值后，就会触发数据依赖子离子扫描模式，进而获得对应母离子精确质量数的二级离子全扫描质谱信息；找到碱性水解后消失的毒素组分，然后将毒素组分的二级质谱离子碎片与已有标准溶液的进行对比，若毒素组分中的特征离子碎片和典型脱水峰簇与已有标准溶液的相同，则为酯化态毒素；另外，特征离子碎片和典型脱水峰簇也将作为酯化态毒素的归类依据；综合以上进行酯化态毒素的定量分析和定性确证。步骤（1）：甲醇水溶液为体积分数80%的甲醇水溶液。步骤（2）：按照毒素提取液中含水比例为60%进行稀释。步骤（3）：确定质谱参数为正离子扫描模式和碰撞能为CE10/30eV。在本专利技术中，首先采用80%甲醇提取毒素，然后利用StrataTM-X固相萃取小柱富集净化毒素，同时，优化组合型四极杆Orbitrap高分辨液质联用仪质谱信息参数，在CE10/30eV和正离子模式下比较各物质水解前后总离子流图和提取离子流图，并且将其特征二级离子碎片产物和典型脱水峰簇与标准品的进行对比，进一步确定分析大田软海绵酸多种酯化态毒素的高通量筛查和定性方法。而且应用本技术筛查和鉴定了利玛原甲藻（Prorocentrumlima,HN45株）的不同生长周期（缓慢生长期、对数生长期和稳定期）中大田软海绵酸的多种酯化态毒素，并获得了毒素种类和含量，进一步验证了本专利技术的准确性和可靠性，为藻细胞中大田软海绵酸的多种酯化态毒素的筛查和定性提供了技术手段。本专利技术的有益效果：本专利技术解决了腹泻性贝类毒素及其酯化态的系统检测问题。通过优化的前处理方法，可以实现多参数的高效率提取，提取率是保障筛查有效性的必要条件。应用系统的仪器筛查方法，最大限度的满足离子通过率及二级碎片的获取，同时达到高通量筛查和精准定性的目的。应用本方法进行的筛查工作，能最大限度的提高产品的腹泻性贝类毒素及其酯化态的质量安全筛查要求，保障消费者的质量安全。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1是本专利技术腹泻性贝类毒素的提取、筛查与质谱确证流程。图2是腹泻性贝类毒素结构式。图3是我国海域常见腹泻性贝类毒素及其酯化态全扫描质谱图的图，1-OA、2-OA-D9b、3-OA-D8a、4-DTX-1、5-35SDTX-1、6-DTX-1-D6和7-DTX-1-D9b。图4是OA和DTX-1在正/负离子模式下二级质谱响应。图5是利马原甲藻中腹泻性贝类毒素及其酯化态提取离子流图。图6是不同生长周期中游离态毒素（A）和总毒素（B）组成及单细胞产毒量。图7是渤海株（a）和南海株（b）腹泻性贝类毒素酯化态组成。具体实施方式实施例1本实施例提供一种腹泻性贝类毒素及其酯化态提取、筛查与质谱确证方法。1、本实施例选用的仪器和试材：（1）Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统及DionexUltiMate3000超高效液相色谱系统（Thermo-Fisher公司）；MGC-450BP-2-P光照培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ-300E超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）；HimacCR22GⅡ高速离心机（Hitachi公司）；N-EVAP112氮吹仪（Organomation公司）；HWS-26电热恒温水浴锅（上海圣科仪器设备有限公司）；Milli-Q超纯水仪（Millipore公司）；固相萃取装置（Supelco公司）。（2）毒素标准品：大田软海绵本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.腹泻性贝类毒素及其酯化态提取、筛查与质谱确证方法，其特征在于，包括下列步骤：/n（1）毒素提取：/n收集平台期藻细胞，加入毒素提取剂，毒素提取剂为甲醇水溶液，涡旋混合，超声提取、离心，移取上清液至离心管中待净化；/n（2）毒素净化：/n用去离子水将提取液稀释，加载到Strata

【技术特征摘要】
1.腹泻性贝类毒素及其酯化态提取、筛查与质谱确证方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）毒素提取：
收集平台期藻细胞，加入毒素提取剂，毒素提取剂为甲醇水溶液，涡旋混合，超声提取、离心，移取上清液至离心管中待净化；
（2）毒素净化：
用去离子水将提取液稀释，加载到StrataTM-X固相萃取柱上，收集洗脱液，氮气吹干，再用甲醇定容，高速离心，吸取洗脱液上清液过0.2μm滤膜后得样品待测液；
（3）组合型四极杆Orbitrap高分辨液质联用仪测定：
根据不同正负离子扫描模式和碰撞能下各组分的裂解情况确定多级质谱条件参数，将已有标准溶液和待测样品进样依次测定，以标准溶液各组分的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归分析，利用峰面积归一化法测定酯化态毒素的相对近似含量；
（4）定量分析和定性确证：
采用组合型四极杆Orbitrap高分辨质谱的一级母离子全扫描加数据依赖的二级子离子扫描模式（FullMS/dd-MS2），...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海燕，谭志军，陈佳琦，仲云，郭萌萌，郑关超，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37