一种药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法技术

本发明专利技术提出一种药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法，采用质谱血清代谢组学技术与数理统计方法寻找与药源性急性肾损伤相关的进展性代谢标志物，并采用ROC曲线确证标志物的诊断能力，最终确定反映药源性急性肾损伤病变进程的代谢标志物。本发明专利技术通过机体血清中内源性代谢标志物含量的变化过程，筛选反映药源性急性肾损伤病变进程的代谢标志物，解决了现有药源性急性肾损伤病变进程评价方法的缺点，最终依据确定的代谢标志物对药源性急性肾损伤病变进程进行评价，具有可量化、快速、灵敏度高、特异性强、无创伤的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法
本专利技术属于标志物筛选鉴定
，尤其是一种药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法。
技术介绍
药源性急性肾损伤是肾脏对治疗剂量药物的不良反应和因药物过量或不合理应用而出现的毒性反应。药源性急性肾损伤可以达到急性肾损伤的1/4，而且急性肾损伤易导致为慢性肾损伤。因此，早期认识及诊断药源性急性肾损伤，对预防晚期急性肾损伤的发生尤其重要。顺铂诱导的小鼠肾损伤模型是一种模拟人类肾脏疾病的动物模型，其临床表现接近药源性急性肾损伤的特征。实验中可依据24h尿蛋白定量判断药源性急性肾损伤模型复制成功与否，而肾病的病理类型及病变程度主要依据肾组织病理学检查，不仅主观性强且耗时耗力，目前尚无药源性急性肾损伤进程动态评价方法，因而需要建立一种整体非入侵、快速、高灵敏度、专属性好的可用于急性肾病诊断以及动态反映疾病病程的方法。代谢组学以其不断增加的覆盖范围及其内在的高通量能力在许多领域中得到应用，如疾病诊断和治疗，药物毒性研究，生物标志物发现以及疾病机制探索等。血清中含有原型药物成分及其代谢产物，在反映肾脏状态方面具有很大优势。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题在于提供一种药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法，通过质谱血清代谢组学技术与数理统计方法寻找与药源性急性肾损伤相关的潜在进展性代谢标志物，并采用ROC曲线确证标志物的诊断能力，最终确定反映药源性急性肾损伤病变进程的代谢标志物，具有可量化、快速、灵敏度高、特异性强、无创伤的特点。实现本专利技术目的的技术解决方案为：一种药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法，包括以下步骤：步骤1：采用腹腔注射20mg/kg顺铂进行诱导，建立药源性急性肾损伤小鼠模型；采用腹腔注射20mg/kg生理盐水，建立空白对照组小鼠；步骤2：收集空白对照组小鼠血清；在建立小鼠模型后的第6h、12h、24h、48h、72h、168h分别收集小鼠模型的血清，形成6h小鼠模型血清、12h小鼠模型血清、24h小鼠模型血清、48h小鼠模型血清、72h小鼠模型血清、168h小鼠模型血清，再分别对空白对照组小鼠血清和小鼠模型血清进行液质联用分析，得到小鼠模型的代谢物液相指纹图谱；步骤3：使用XCMS软件对小鼠模型的代谢物液相指纹图谱进行峰提取、峰识别、峰匹配、峰对齐及归一化等数据预处理，得到包含保留时间Rt、质荷比m/z和峰高的代谢轮廓数据，再将代谢轮廓数据导入SIMCA-P软件进行处理得到差异代谢物；步骤4：计算各差异代谢物的变化率，结合单因素方差分析、随机森林算法、Pearson相关系数筛选以及代谢物的定性分析，确定药源性急性肾损伤病变进程的进展性代谢标志物；步骤5：依据ROC曲线下与坐标轴围成的面积AUC来评估进展性代谢标志物的诊断准确性：将AUC＞0.7的进展性代谢标志物作为反映药源性急性肾损伤病变进程的代谢标志物。进一步的，本专利技术的药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法，步骤5中所述反映药源性急性肾损伤病变进程的代谢标志物包括Toxopyrimidine、Phthalicacid、Atagabalin、2-Methyl-4,6-dinitrophenol、Myristylsulfate、Taurine、Benactyzine、Fasoracetam、Eicosapentaenoicacid、Trepibutone、9-Decenoylcarnitine、Xanthohumol、3',4'-methylenedioxy-alpha-pyrrolidinobutiophenone。进一步的，本专利技术的药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法，步骤4具体步骤包括：步骤4-1：对步骤3得到的差异代谢物采用单因素方差分析进行初筛，通过显著差性异比较，以p<0.05作为判别条件，去除不满足条件的差异值，获得潜在代谢标志物；步骤4-2：对步骤4-1得到的潜在差异代谢物采用随机森林算法进行筛选，以MeanDecreaseAccuracy>0.001作为判别条件，获得潜在进展性代谢标志物；步骤4-3：对步骤4-2得到的潜在进展性代谢标志物采用Pearson相关性分析，以R2>0.7作为判别条件，获得时间依赖型潜在进展性代谢标志物，所述时间依赖型潜在进展性代谢标志物在整个周期中变化趋势一致；步骤4-4：对步骤4-3得到的时间依赖型潜在进展性代谢标志物，通过使用HMDB数据库与相关文献并结合二级碎片离子进行定性分析，排除假阳性结果即数据库中无法查到且两次保留时间大于允许偏差0.2min，将最终筛选到的代谢物确定为进展性代谢标志物。进一步的，本专利技术的药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法，步骤3中寻找差异代谢物的步骤具体包括：在正负离子模式下，对空白对照组小鼠血清和小鼠模型血清的代谢轮廓数据进行无监督模式识别的主成分分析，再采用有监督的偏最小二乘法判别分析与正交偏最小二乘法判别分析确定空白对照组代谢物轮廓与小鼠模型代谢轮廓存在显著差异，最后结合正交偏最小二乘法判别分析中VIP值＞1、S-plot中Pvalue值＞0.58以及独立样本t-test检验P＜0.05，得到具有显著性的差异代谢物。进一步的，本专利技术的药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法，步骤2中的液质联用分析的条件为：色谱条件：WatersACQUITYUHPLCTMBEHC18色谱柱，流动相A为含0.1％甲酸的水，流动相B为乙腈，体积流量0.3μL/min；UV检测波长254nm；柱温30℃；进样量3μL；洗脱梯度为：0-2min，2％B；2-3min，2-35％B；3-17min，35-70％B；17-18min，70％B；18-29min，70-98％B；29-31min，98％B；31-33min，98-2％B；33-35min，2％B；质谱条件：采用HESI离子化方式，喷雾电压正极3.5kV、负极2.5kV，碰撞能量为12.5、25、37.5eV；加热器温度300℃，毛细管温度320℃，辅助气体积流量10arb，鞘气体积流量35arb；采集模式为正负离子切换，扫描模式采用FullScan/dd-MS2，采集范围为m/z100～1500；分辨率采用MSFullScan35000FWHM，MS/MS17500FWHM。一种采用上述筛选方法获取的药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物在制备药源性急性肾损伤病变进程诊断鉴别试剂中的应用。本专利技术采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：本专利技术的药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法采用顺铂所致的急性肾损伤模型模拟药源性急性肾损伤，结合质谱血清代谢组学技术与数理统计方法寻找与药源性急性肾损伤相关的潜在进展性代谢标志物，并采用ROC曲线确证该标志物的诊断能力，与传统血清生化指标或肾脏组织病理分析相比，可量化，具有快速、灵敏度高、特异性强且无创伤的特点。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1：采用腹腔注射20mg/kg顺铂进行诱导，建立药源性急性肾损伤小鼠模型；采用腹腔注射20mg/kg生理盐水，建立空白对照组小鼠；/n步骤2：收集空白对照组小鼠血清；在建立小鼠模型后的第6h、12h、24h、48h、72h、168h分别收集小鼠模型的血清，形成6h小鼠模型血清、12h小鼠模型血清、24h小鼠模型血清、48h小鼠模型血清、72h小鼠模型血清、168h小鼠模型血清，再分别对空白对照组小鼠血清和小鼠模型血清进行液质联用分析，得到小鼠模型的代谢物液相指纹图谱；/n步骤3：使用XCMS软件对小鼠模型的代谢物液相指纹图谱进行峰提取、峰识别、峰匹配、峰对齐及归一化等数据预处理，得到包含保留时间Rt、质荷比m/z和峰高的代谢轮廓数据，再将代谢轮廓数据导入SIMCA-P软件进行处理得到差异代谢物；/n步骤4：计算各差异代谢物的变化率，结合单因素方差分析、随机森林算法、Pearson相关系数筛选以及代谢物的定性分析，确定药源性急性肾损伤病变进程的进展性代谢标志物；/n步骤5：依据ROC曲线下与坐标轴围成的面积AUC来评估进展性代谢标志物的诊断准确性：将AUC＞0.7的进展性代谢标志物作为反映药源性急性肾损伤病变进程的代谢标志物。/n...

【技术特征摘要】
1.一种药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用腹腔注射20mg/kg顺铂进行诱导，建立药源性急性肾损伤小鼠模型；采用腹腔注射20mg/kg生理盐水，建立空白对照组小鼠；
步骤2：收集空白对照组小鼠血清；在建立小鼠模型后的第6h、12h、24h、48h、72h、168h分别收集小鼠模型的血清，形成6h小鼠模型血清、12h小鼠模型血清、24h小鼠模型血清、48h小鼠模型血清、72h小鼠模型血清、168h小鼠模型血清，再分别对空白对照组小鼠血清和小鼠模型血清进行液质联用分析，得到小鼠模型的代谢物液相指纹图谱；
步骤3：使用XCMS软件对小鼠模型的代谢物液相指纹图谱进行峰提取、峰识别、峰匹配、峰对齐及归一化等数据预处理，得到包含保留时间Rt、质荷比m/z和峰高的代谢轮廓数据，再将代谢轮廓数据导入SIMCA-P软件进行处理得到差异代谢物；
步骤4：计算各差异代谢物的变化率，结合单因素方差分析、随机森林算法、Pearson相关系数筛选以及代谢物的定性分析，确定药源性急性肾损伤病变进程的进展性代谢标志物；
步骤5：依据ROC曲线下与坐标轴围成的面积AUC来评估进展性代谢标志物的诊断准确性：将AUC＞0.7的进展性代谢标志物作为反映药源性急性肾损伤病变进程的代谢标志物。


2.根据权利要求1所述的药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法，其特征在于，步骤5中所述反映药源性急性肾损伤病变进程的代谢标志物包括Toxopyrimidine、Phthalicacid、Atagabalin、2-Methyl-4,6-dinitrophenol、Myristylsulfate、Taurine、Benactyzine、Fasoracetam、Eicosapentaenoicacid、Trepibutone、9-Decenoylcarnitine、Xanthohumol、3',4'-methylenedioxy-alpha-pyrrolidinobutiophenone。


3.根据权利要求1所述的药源性急性肾损伤病变进程代谢标志物的筛选方法，其特征在于，步骤4具体步骤包括：
步骤4-1：对步骤3得到的差异代谢物采用单因素方差分析进行初筛，通过显著差性异比较，以p<0.05作为判别条件，去除不满足条件的差异值，获得潜在代谢标志物；
步骤4-2：对步骤4-1得到的潜在差异代谢物采用随机森林算法进行筛选，以MeanDecreaseAccu...

【专利技术属性】
技术研发人员：田蒋为，张王宁，吴燕，张文泽，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32